β连环素在原发性肝细胞癌中的异常表达及其意义

β连环素在原发性肝细胞癌中的异常表达及其意义作者：申海军 顾红光 金世龙　    作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科    【摘要】  目的 探讨β连环素(βcatenin)在原发性肝细胞癌发生及发展过程中的异常表达及其意义。方法 应用免疫组织化学法检测20例正常肝组织、20例肝炎后肝硬化组织和40例原发性肝细胞癌组织中βcatenin的表达。结果 正常肝组织中的βcatenin几乎全部定位表达于细胞膜，细胞质中非常少见。31例患者细胞膜上βcatenin表达缺失，缺失率为77.5%(31/40)，26例细胞质中有异位表达，异位表达率为65%(26/40)。4例肝炎后肝硬化患者细胞膜表达缺失，缺失率为20%(4/20)，9例细胞质中有异位表达，异位表达率为45%(9/20)。结论 βcatenin异常表达对原发性肝细胞癌的发生及发展可能具有重要作用。    【关键词】  β连环素 原发性肝细胞癌 免疫组织化学    Ectopic expression of βcatenin in primary hepatocellular carcinoma and its significance  SHEN Haijun, GU Hongguang, JIN Shilong. Department of Hepatobiliary Surgery, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China   【Abstract】  Objective  To investigate the ectopic expression of the βcatenin and its significance in development of primary hepatocellular carcinoma. Methods  The expression of βcatenin on mucosa of normal hepatic tissues (20 cases), hepatitic cirrhosis (20 cases) and primary hepatocellular carcinoma (40 cases) was detected by means of immunohistochemistry technique. Results  In normal hepatic tissues, βcatenin expressed mainly on the cellular membrane, with little expression in cytoplasm. In 40 cases with primary hepatocellular carcinoma, there found decreased expression of βcatenin on cellular membrane in 31 cases, with decrease rate of 77.5% (31/40), and ectopic expression of βcatenin in mucosa in 26 cases, with ectopic expression rate of 65% (26/40). While in 20 cases with hepatic cirrhosis, decreased expression of βcatenin on mucosa was detected in four cases, with decrease rate of 20% (4/20), but ectopic expression was found in nine cases, with ectopic expression rate of 45% (9/20), both of which were lower than that of normal hepatic tissues but higher than that of primary hepatocellular carcinoma tissues. Conclusions  During development of primary hepatocellular carcinoma, there is ectopic expression of βcatenin on cellular membrane and cytoplasm, which may play a pivotal role in development of primary hepatocellular carcinoma.   【Key words】  βcatenin; Primary hepatocellular carcinoma;  Immunohistochemistry    原发性肝细胞癌是严重威胁人民群众健康的常见恶性肿瘤之一［1］，而肝炎后肝硬化又被视为肝细胞肝癌的癌前病变。近年来，许多研究发现wnt信号通路与原发性肝细胞癌的发生发展有密切关系，β连环素(βcatenin)是wnt信号通路中重要的蛋白。因此，βcatenin可能在原发性肝细胞癌的发生发展中有重要作用。本实验采用免疫组化染色方法检测正常肝组织、肝炎后肝硬化组织和原发性肝细胞癌组织中βcatenin的表达情况， 旨在探讨βcatenin在原发性肝癌的形成、发展中的作用。1  材料与方法    1.1  临床资料    收集2004年10月至2005年12月我院手术切除的40例原发性肝细胞癌患者组织，其中男性28例，女性12例；平均年龄52.4岁。正常肝组织20例取自无肝炎病史、肝功能正常患者，行单纯胆囊切除术所取肝脏活检组织，女性12例，男性8例；平均年龄45.3岁。肝硬化组织取自20例肝炎后肝硬化、门静脉高压症行脾切除术、门奇断流术患者，其中男性14例，女性6例；平均年龄52.3岁。上述组织均经病理学证实。    1.2  主要试剂    鼠抗人βcatenin单克隆抗体，购自Sigma公司，工作浓度为1∶100；二抗为Power VisionTM(IgG抗体HRP多聚体)复合物，购自北京中山生物制剂有限公司。    1.3  方法    采用免疫组化Power VisionTM二步法：收集标本后甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，烤干，二甲苯脱蜡，经100%，95%，80%酒精梯度脱水，自来水漂洗，3%双氧水孵育10 min，PBS漂洗5 min×3，浸入0.001 mol/L(pH6.0)枸橼酸盐缓冲液中，置于微波炉内中火(92～98 ℃)抗原热修复15 min，冷却，PBS漂洗5 min×3，滴加一抗(1∶100)，4 ℃过夜，PBS漂洗5 min×3，滴加增敏剂，37 ℃热孵30 min，加二抗，37 ℃热孵30 min，DBA显色剂显色5～30 min，苏木精复染10 s，饱和碳酸锂10 s，依次经95%～100%酒精脱水，吹干，封片，镜下观察，照相，以PBS作阴性对照。以细胞膜、细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达。    判断标准按Maruyama等［2］方法，观察细胞膜、细胞质表达情况，当细胞膜阳性表达>77%为正常表达，反之为异常表达(异位表达或者有膜缺失)，细胞质阳性表达>10%为异位表达。    申海军，等. β连环素在原发性肝细胞癌中的异常表达及其意义  1.4  统计学处理    采用SPSS 10.0统计软件进行χ2检验。2  结果    2.1  βcatenin在正常肝组织中的表达    正常肝组织中，细胞膜出现明显的棕黄色染色，细胞膜清晰可见，仅个别细胞的细胞质中出现较浅的棕黄色染色(图1)。    图1  细胞膜清晰可见，细胞膜出现明显的棕黄色染色，细胞质中未出现棕黄色染色  (Power VisionTM染色  ×200)    2.2  βcatenin在肝炎后肝硬化组织中的表达    肝炎后肝硬化组织中，可见完整的细胞膜，大部分细胞的细胞膜上有明显的棕黄色染色, 部分细胞的细胞质中出现棕黄色染色(图2)。肝炎后肝硬化组织20例中有4例细胞膜表达缺失，缺失率为20%，9例细胞质中有异位表达， 异位表达率为45%， 均低于正常肝组织， 高于原发性肝细胞肝癌组织。    图2  细胞膜上有明显的棕黄色染色，部分细胞的胞质中出现棕黄色染色  (Power VisionTM染色  ×200)    2.3  βcatenin在原发性肝细胞癌组织中的表达    原发性肝细胞癌组织几乎所有的细胞膜未现棕黄色染色，细胞膜表达有明显的缺失，细胞膜结构因未着色几乎看不清楚，而大部分细胞质中出现清晰的深棕黄色染色(图3)，细胞质的异位表达明显增加。在原发性肝细胞癌40例中31例的细胞膜上βcatenin表达缺失，缺失率为77.5%，26例的细胞质中有异位表达，表达率为65%，明显高于肝炎后肝硬化组织。    图3  细胞膜结构因未着色，几乎看不清楚，细胞质中出现清晰的深棕黄色染色  (Power VisionTM染色  ×200)    βcatenin在3种组织细胞质的表达：肝硬化组织高于正常肝组织(P<0.05)，肝癌组织明显高于肝硬化组织(P<0.05)。βcatenin在3种组织细胞膜缺失率差异有统计学意义(表1)，肝硬化组织高于正常肝组织(P<0.05)，肝癌组织明显高于肝硬化组织(P<0.05)。表1  βcatenin在3种肝组织中表达情况3  讨论    近年来的研究发现在成年脊椎动物中wnt基因与内环境和肿瘤的发生有密切关系［3］。wnt信号通路是一条控制动物胚胎发育及细胞命运的重要信号通路。wnt基因控制wnt蛋白合成，wnt蛋白到达靶细胞时与靶细胞中的跨膜受体卷曲(frizzled)蛋白特异性结合，将信息传到细胞内，进入细胞内后，经DSH蛋白传至GSK3并与其结合使其去磷酸化。GSK3主要功能是降解βcatenin，使其在细胞质中的浓度降低，保持在低水平，不能进入细胞核调控相关基因表达［4］。当GSK3被抑制后，βcatenin降解中断，细胞质中游离的βcatenin增多，增多到一定水平与T细胞因子4(Tcf4)结合形成复合物，然后进入细胞核与Tcf/Lef(T cell transcripronal factor/Lymphoid enhancer factor)族含有HMG盒(hight mobility group,DNA结合区)的转录活化因子作用，调节cmyc、cyclin D1等靶基因的转录，推动细胞周期发展使细胞增殖加快和导致异常蛋白质产生，进而加速肿瘤形成和细胞癌变。因此βcatenin是wnt信号传导途径中的关键因子。    最近的研究［5］表明βcatenin基因的突变在人类多种肿瘤中出现，βcatenin基因突变导致βcatenin的降解中断，在细胞质中积聚，导致肿瘤的发生。βcatenin在细胞质中异位表达与大肠癌［6］、卵巢癌［7］发生发展有密切关系，大肠癌、卵巢癌中βcatenin中普遍存在βcatenin的异位表达。    在正常细胞中βcatenin分布于细胞膜上，与细胞间的黏附有关，同上皮钙黏蛋白(Ecadherin)一致［8］。在肝部分切除的动物模型中观察到βcatenin有所上调，为了增加细胞间的粘附［9］，其上调恰好与Ecadherin的下调一致，即βcatenin下调则Ecadherin上调［10］。βcatenin在细胞中与Ecadherin形成复合物并插入细胞膜，很少能游离于胞质中，在细胞质中保持低水平。    本研究观察从正常肝组织→肝炎后肝硬化→原发性肝细胞癌的发展过程中βcatenin表达改变，结果显示在正常肝组织中βcatenin几乎全部定位于细胞膜上，细胞核未见表达。肝硬化组织中βcatenin细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均高于正常肝组织(P＜0.05)。在原发性肝细胞癌组织中βcatenin在细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均高于正常肝组织和肝硬化组织(P＜0.05)。这些结果表明在原发性肝细胞癌的形成过程中，βcatenin逐渐由细胞膜转移至细胞质，并在细胞质中聚集，胞质聚集到一定水平进入细胞核激活相关基因诱发肝细胞癌变，同时细胞膜上的βcatenin使细胞间的粘连减少，使肿瘤的生长和转移有了可能。这提示βcatenin异位表达与原发性肝细胞癌的发生、发展有密切关系，也可能是癌肿较易发生转移的重要原因之一。有报道［11］βcatenin在细胞膜和细胞质重新定位在人类多种肿瘤中出现，βcatenin由细胞膜到细胞质的异位是激活wnt途径的关键步骤，wnt途径的激活最终导致了原发性肝细胞肝癌的发生，而βcatenin细胞定位的改变的主要原因是βcatenin基因的突变。有研究［12］显示前列腺癌的转移和患者的存活时间与βcatenin异位表达率有关。本研究结果提示观察βcatenin的细胞膜和细胞质异位表达情况可以早期预测诊断原发性肝细胞癌，可能为肝癌的早期诊断提供了新的途径。【参考文献】  ［1］ Murray C J, Lopez A D. 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