腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究
发表时间：2009-12-24 浏览次数：591次
腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究作者：陈健 李大江 王曙光 作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院 【摘要】 目的 探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响，为胆管癌的治疗探索新方法。方法 采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939，在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况，同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果 胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65，在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡，并且随着时间的推移其作用越明显，在第7天凋亡率达到61.9%。结论 凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡，在胆管癌的治疗上具有较大潜力。 【关键词】 凋亡素基因； 腺病毒载体； 基因治疗； 胆管癌 Effect of adenovirusmediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells CHEN Jian, LI Dajiang, WANG Shuguang. Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China Corresponding author: WANG Shuguang, Email: sgwang1959@sina.com 【Abstract】 Objective To study the effect of adenovirusmediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells and explore new ways to manage bile duct carcinoma. Methods The human bile duct carcinoma cell line QBC939 was transfected by recombinant adenovirus carrying apoptin gene. After the multiplicity of infection was determined successfully, the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 was observed by light microscopy and fluorescence microscopy and the rate of apoptosis detected by TUNEL stain. Results The value of multiplicity of infection of human bile duct carcinoma cell line QBC939 transfected by recombinant adenovirus was 65. Apoptin gene started to induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 on the 3rd day and the induction function of apoptin gene increased with time. The apoptosis index of human bile duct carcinoma cell line QBC939 reached 61.9% on the 7th day. Conclusion The apoptin gene can obviously induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939, and may be a powerful tool to treat cholangiocarcinoma. 【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy; Cholangiocarcinoma 凋亡素， 又称Apoptin(apoptosis induction)，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发一些肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而对正常细胞无此作用。这提示凋亡素在肿瘤的治疗上具有较大潜力［1］。目前胆管癌的治疗效果难尽人意，迫切需要探索新的治疗方法。本实验利用腺病毒为载体转染人胆管癌细胞株，以观察凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的影响程度，以期探索治疗胆管癌的新方法。1 材料与方法 1.1 材料 我们已成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒载体［2］。不含目的基因的腺病毒载体由第三军医大学西南医院烧伤研究所贺伟峰提供；人胆管癌细胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin 3型细胞离心机购自美国Shandon公司；TUNEL试剂购自德国Roche公司。 1.2 方法 1.2.1 QBC939细胞的重组腺病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)的测定：在6孔板上传5×105/孔培养QBC939细胞，细胞过夜生长。将病毒量为6.56×109 pfu/ml的病毒稀释5倍后分别取2、5、10、25、50 μl(相应的病毒量为：2.61×106、6.56×106、1.31×107、3.28×107、6.56×107)加入6孔板中的5孔，第6孔作为对照。同时加培养液500 μl，5% CO2、37 ℃条件下孵育。间隔30 min轻轻摇晃数次，使之与细胞充分接触，孵育3 h后加入培养液1500 μl，72 h后用荧光显微镜观察细胞的荧光情况。选取接近100%的细胞发荧光的孔所对应的病毒量来计算MOI值。公式为MOI=病毒数/细胞数。这样可确定最佳感染复数。 1.2.2 重组腺病毒对胆管癌细胞株QBC939的感染： 根据上一步探索出的最适MOI来决定病毒的量， 每日通过荧光显微镜观察并记录QBC939细胞的情况。在1、3、5、7 d后分别收集细胞爬片， 对于脱落的细胞采用制成细胞甩片来观察。实验共分3组， 重组腺病毒组、 空病毒组和空白组(培养液组)。甩片的制作为： 100×g离心10 min， 用PBS洗涤细胞1次， 然后用4 ml PBS重溶细胞， 记录收集的细胞数目约为4000个。将1/10的液体加入与甩片装置安装好的玻片上， 1000×g离心10 min后制成细胞甩片。 1.2.3 人胆管癌细胞爬片及甩片的TUNEL染色：人胆管癌细胞爬片和甩片的TUNEL染色严格按照试剂盒说明书进行。同时计算凋亡率。公式为：凋亡率(Apoptosis Index,AI)=阳性细胞数/500细胞总数×100%。 1.3 统计学分析 SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，各组间分别进行独立样本t检验检测均值， 结果用±s表示。2 结果 2.1 胆管癌细胞株QBC939的最适腺病毒MOI值 我们用不同腺病毒浓度对应MOI分别为5.3、13.1、26.2、65和131。随着MOI的提高，胆管癌细胞株的感染率也相应提高，但同时也出现了细胞脱壁现象的增加。这提示腺病毒的毒性作用也随之增大。所以最适MOI应该是细胞的感染率较高，同时细胞脱落和其对应的毒性作用相对较低。因此我们确定MOI为65是含凋亡素基因腺病毒的最适感染复数值(图1)。同时MOI为65所对应的空病毒感染也提示感染率很高，细胞脱落现象较少。所以我们也将此值作为空病毒的最适感染复数值。 A：重组腺病毒组光镜图； B：重组腺病毒组荧光图； C：空病毒组光镜图； D：空病毒组荧光图 图1 胆管癌细胞株QBC939的最适腺病毒为65的光镜和荧光观察结果 (×400) 2.2 重组腺病毒感染QBC939细胞后的变化 我们从胆管癌细胞株QBC939的光镜和荧光照片观察到如下现象：(1)光镜下，细胞在感染含凋亡素基因的病毒后第1天可观察到有少量细胞脱落，同时细胞开始出现感染病毒后的变化：细胞略肿胀，有少量细胞融合，但细胞排列结构没有变化，随着感染时间延长，细胞脱落数增加，细胞开始变小，细胞核和细胞质缩小，细胞巢状生长的密度明显降低。少数细胞可明显观察到核仁沿核膜排列呈新月状。在感染后第7天可观察到细胞核变成两个核，细胞变小，有些细胞已经失去正常结构成为碎片样。空病毒组和空白对照组以上变化不明显，反而是细胞密度增加，细胞脱落数目较含凋亡素基因的腺病毒明显减少。(2)荧光下，第4天观察到大部分细胞发出荧光。 这说明在第4天腺病毒的感染才达到高峰。这时，含凋亡素基因腺病毒感染的细胞脱落量较空病毒组和空白对照组大，并且脱落的细胞也呈现荧光，有些细胞轮廓明显变小，荧光强度明显增加，也有一些细胞结构消失，变为散状的荧光碎片，而空病毒组以上变化不明显(图2)。 2.3 腺病毒感染后QBC939细胞的TUNEL染色及统计结果 我们的实验中胆管癌细胞含有荧光蛋白，所以采用复染后封片观察。其阳性结果是细胞核染成棕色，而非凋亡细胞则为蓝色。从图3可看出，含凋亡素基因的腺病毒感染胆管癌细胞后出现细胞核的棕色染色较空病毒组和空白对照组明显增多。 从图4可看出， 随着时间的推移， 含凋亡素基因腺病毒感染QBC939细胞的凋亡率是逐渐增高。从第3天开始， 含凋亡素基因的腺病毒组的凋亡率较其他两组明显增高。随着时间的延长， 差异越来越明显。这充分说明凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡。含凋亡素基因的腺病毒组的凋亡率在第7天可达61.9%， 而空病毒感染的QBC939细胞的凋亡率为10.91%， 正常QBC939细胞的凋亡率为6.89%。显示正常的胆管癌细胞是存在凋亡的， 但凋亡率较低。含凋亡素基因的腺病毒引发QBC939细胞的凋亡较空病毒组和空白对照组明显增高， 表明凋亡素能引发胆管癌QBC939细胞的凋亡。 A：重组腺病毒组光镜图； B：重组腺病毒组荧光图； C：空病毒组光镜图； D：空病毒组荧光图 图2 腺病毒感染QBC939细胞后7 d的光镜和荧光观察结果 (×400) A：重组腺病毒组爬片结果； B：重组腺病毒组甩片结果； C：空病毒组爬片结果； D：空病毒组甩片结果； E：空白对照组爬片结果； F：空白对照组甩片结果 图3 腺病毒感染QBC939细胞后7 d的染色结果 (TUNEL ×400) 图4 腺病毒感染QBC939细胞后的凋亡率折线图3 讨论 正常胆管上皮细胞的更新和凋亡是维持动态平衡的。当其受损， 必然会引发癌基因和抑癌基因的 突变， 特别是凋亡相关基因的突变， 使本该凋亡的缺陷细胞得以生存， 并不断增殖而可能形成肿瘤。所以胆管癌的发生、 发展也是机体引发凋亡失败的结果。当胆管癌形成后由于局部缺血、 基质反应失控和内在凋亡机制的激活会出现自发的凋亡现象［4］。张丰深等［5］发现胆管癌临床标本的自发凋亡率约为7.89%， 而且低分化和具有转移潜能的胆管癌细胞的自发凋亡率较低。由此判断自发凋亡率低的胆管癌细胞可能具有更多的逃避凋亡的机制， 因此， 诱发转化的胆管上皮细胞和胆管癌细胞的凋亡在预防和治疗胆管癌以及抑制其转移都具有重要意义。 凋亡素是外来蛋白，对多数转化细胞和肿瘤细胞具有促凋亡作用，而对正常细胞无凋亡效应和毒副作用。故其在肿瘤的治疗上有广阔的前景［6］。而胆管癌由于本身特殊的生物学行为，在临床上明确诊断后往往属于中晚期，手术切除率低，复发率高，临床疗效难尽人意。所以人们开始探索新的治疗方法，特别是基因治疗，希望能极大提高它的疗效［7］。因此我们运用基因工程技术构建了含凋亡素基因的腺病毒并转染胆管癌细胞株QBC939，考虑到在脱落细胞中也存在凋亡细胞，为准确统计凋亡率，我们将脱落细胞制成甩片进行染色，以便更全面的了解凋亡素基因对胆管癌细胞的作用。结果发现凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡，凋亡率可达到61.9%，与Noteborn［8］在其他肿瘤的研究结果相似。但凋亡率较他们的结果相对偏低，可能有如下原因：(1)肿瘤细胞凋亡的异质性。由于肿瘤细胞本身的遗传背景使凋亡素引发不同肿瘤细胞的凋亡率是不会相同的。(2)虽然腺病毒的感染率很高，仍会有少量的细胞不被感染，而胆管癌细胞的生长速度很快，加之凋亡素最高效应的发挥是在第5天左右，因此我们得到的结果偏低，但也明显高于空病毒感染的胆管癌细胞和其自发的凋亡。本研究提示凋亡素能明显抑制胆管癌细胞的生长，在胆管癌的治疗上具有较大的潜力。【参考文献】 ［1］ Maddika S, Mendoza F, Hauff K, et al. 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