人高迁移率族蛋白突变体抗炎效应的初步研究

人高迁移率族蛋白突变体抗炎效应的初步研究作者：陈婧 袁志强 彭毅志    作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院烧伤研究所     【摘要】  目的 构建6个高迁移率族蛋白1(high mobility group1 protein,HMGB1)突变体，从中筛选出与靶细胞膜上受体结合但没有致炎效应的突变体蛋白，并检测其在体外竞争性抑制HMGB1致炎效应的作用。方法 在已成功制备HMGB1及其6个重组HMGB1突变体蛋白的基础上，对目的蛋白进行了有效纯化。采用细胞免疫荧光标记、激光共聚焦显微镜筛选出能与THP1细胞膜上受体结合的突变体。再通过ELISA筛选出没有致炎效应的突变体。进一步筛选出能在体外竞争性抑制HMGB1致炎效应的突变体。结果 筛选出的HMGB1 M1、M2、M3、M5能在体外竞争性抑制HMGB1的致炎效应，其中M1、M2竞争性抑制作用最强。结论 成功筛选出在体外竞争性抑制HMGB1致炎效应的重组突变体，为抗炎治疗提供新型候选制剂。     【关键词】  高迁移率族蛋白； 突变； 表达； 蛋白纯化； 炎症因子     Preliminary study on antiinflammatory effect of human  HMGB1 protein mutants  CHEN Jing, YUAN Zhiqiang, PENG Yizhi. Burn Institute of Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China    Corresponding author: YUAN Zhiqiang, PENG Yizhi, Email: cqburn@yahoo.com.cn    【Abstract】  Objective  To design and prepare 6 recombinant mutanthuman high mobility group box 1 (HMGB1) proteins and select the mutants that can combine with HMGB1 receptors but cannot produce inflammation to detect their competitive inhibition on the inflammatory effect of HMGB1. Methods   The mutants were effectively purified after cloning HMGB1 and 6 recombinant mutant HMGB1s. The mutants that could combine with HMGB1 receptors on the target cellular membrane were selected under confocal microscopy by immunofluorescence. The mutants that could not induce inflammation were selected with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The mutants with competitive inhibitive effect on inflammatory effect of HMGB1 in vitro were further confirmed.Results  The selected HMGB1 M1, M2, M3 and M5 could competitively inhibit inflammatory effect of HMGB1 in vitro. Of all, HMGB1 M1 and M2 had the strongest effect of competitive inhibition.Conclusions  Mutants that can competitively inhibit inflammatory effect of HMGB1 in vitro are successful selected, as may cater a new potential agent for antiinflammation therapy.   【Key words】  High mobility group1 protein;  Mutation;  Expression;  Protein purification;    Inflammatory factor    高迁移率族蛋白1(high mobility group1 protein,HMGB1)是一种在真核细胞中广泛表达并且高度保守的蛋白。最近研究证明，HMGB1是晚期(或宽治疗窗口期)关键的致炎因子。HMGB1能被激活的免疫细胞释放到细胞外环境 ［1-4］，在全身性炎症及脓毒症的发生、发展中起重要作用。本实验旨在通过突变的HMGB1与天然HMGB1竞争结合相应受体而抑制其致炎效应的研究，为抗炎治疗提供新型候选制剂。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  试剂：IPTG为上海Sagon公司产品；低分子量蛋白Marker为上海生化所产品；蛋白纯化用缓冲液(Lysis Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer)、TE缓冲液为西南医院烧伤研究所配制；Ni2+NTA层析系统为德国Qiagen公司产品；人HMGB1抗体为Santa Cruz公司产品；FITC标记兔抗羊多克隆抗体为中杉公司产品；IL1β ELISA试剂盒为晶美公司产品。    1.1.2  细胞： THP1细胞由西南医院烧伤研究所提供。    1.2  方法    1.2.1  人HMGB1的克隆：按照文献［7］方法制备。    1.2.2  人HMGB1突变体的构建：按照文献［8］方法制备。    1.2.3  表达载体的构建及目的蛋白表达：按照文献［8］方法进行。    1.2.4  目的蛋白鉴定(Western blotting)：根据文献［8］方法进行鉴定。    1.2.5  目的蛋白的分离纯化：(1)目的蛋白的大量表达。分别将含有重组原核表达质粒pQE80L/HMGB1及其M1～M6型的大肠杆菌DH5α接种于5 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃、225 r/min振荡过夜。再将菌液按1%分别接种于200 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃剧烈振荡3～4 h，直至OD600在0.6～0.8之间。加入诱导剂 IPTG 至终浓度 1 mmol/L。继续在37 ℃振荡使细菌生长4 h。4 ℃、4000×g离心15 min收集细菌。(2)目的蛋白的分离。每克细菌加入3 ml TE buffer(pH8.0)。加入PMSF至终浓度为1 mmol/L。在冰浴中超声碎菌直至黏稠的菌液变清亮。加入PMSF至终浓度为1 mmol/L。4 ℃、4 000×g离心15 min，收集上清液(经鉴定目的蛋白是以分泌形式表达)。(3)目的蛋白的纯化。将所收集的各纯化后蛋白溶液各取100 μl，加入等体积2×SDSPAGE缓冲液，沸水浴10 min，取20 μl进行SDSPAGE电泳。(4)透析脱盐。(5)目的蛋白装入干净的平皿中，冷冻抽干直至成为白色粉末。将白色粉末置-70 ℃保存、备用。    1.2.6  激光共聚焦：将生长至对数生长期的THP1细胞，PBS洗涤1次，用适量无血清培养基悬浮细胞，加入24孔板中，每孔细胞数约为106个。每孔中分别加入多黏均素B至终浓度达到10 μg/ml。再分别加入纯化的M1～M6突变体蛋白，以及阳性对照(HMGB1)和阴性对照(PBS)，使各种蛋白终浓度为20 μg/ml。置细胞培养箱中孵育4 h后取出，加入PBS配制的2%多聚甲醛冰上固定30 min，将细胞转入EP管中，3 000×g，离心1 min，去上清液，用PBS洗涤2次。再加入200 μl 5% BSA封闭液重悬细胞，37度孵1 h。离心去上清液，用PBS洗2次。分别加入1∶100一抗稀释液100 μl，4 ℃ 1 h。用PBS洗2次。分别加入1∶100二抗稀释液100 μl，4 ℃ 40 min。PBS洗2次后置激光共聚焦显微镜下观察细胞膜上荧光。    1.2.7  IL1β ELISA实验：细胞洗涤后加入各孔，每孔细胞数约为106个，加入多黏菌素，然后分为8组：1～6组中分别加入M1～M6蛋白，第7组为阳性对照(HMGB1蛋白)，第8组作为阴性对照(PBS)，各组蛋白终浓度均为20 μg/ml。每组分别于2、4、6、8 h 4个时相点收集加入不同蛋白的THP1细胞悬液上清，行ELISA检测。    1.2.8  竞争性抑制实验：细胞洗涤后加入各孔，细胞密度约为3.3×106/ml，加入多黏菌素。除阴性对照组(PBS)，其余各组均加入HMGB1至终浓度为20 μg/ml。再加入由IL1β ELISA实验筛选得到的只与受体结合而不诱导炎症因子的突变体蛋白，HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6，蛋白终浓度为20 μg/ml。分别于2、4、6、8 h 4个时相点收集各孔中细胞悬液上清，行ELISA检测。    1.3  统计学分析    数据以±s表示，采用统计处理软件SPSS进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  目的蛋白的分离、纯化    超声碎菌后的上清液经Ni2+NTA柱纯化，然后各重组蛋白分别取样行SDSPAGE，可见各重组蛋白得到有效分离纯化，见图1。    1.Protein Marker；2.重组蛋白HMGB1 M1；3.重组蛋白HMGB1 M2；4.重组蛋白HMGB1 M3；5.重组蛋白HMGB1 M4；6.重组蛋白HMGB1 M5；7.重组蛋白HMGB1 M6；8.重组蛋白HMGB1    图1  各重组蛋白纯化后SDSPAGE电泳图片    2.2  激光共聚焦荧光图像    阳性对照组细胞膜上可见绿色荧光，而阴性对照组细胞膜上绿色荧光较弱。分别加入M1～M6 6个突变体蛋白的THP1细胞膜上均可见明显绿色荧光，见图2～7。    2.2  IL1β ELISA实验结果    阳性与阴性对照组在每个时相点都有差异(P<0.05)。M4组细胞上清液在8 h时相点IL1β含量显著高于阳性对照组，其余各组IL1β含量都低于阳性对照组，其中除M6组外，余各组在某些时相点与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。    2.3  竞争性抑制实验结果    阳性与阴性对照组在每个时相点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HMGB1 M6组在各时相点，其细胞上清中IL1β含量都明显高于阳性对照组，其余各突变体组2～6 h细胞上清液中IL1β含量与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但在6～8 h均能明显抑制HMGB1诱导IL1β的表达。其中HMGB1 M2组细胞上清液中IL1β含量最小，在6、8 h时相点均明显低于阳性对照组(P<0.05)。见图9。3  讨论    3.1  HMGB1—重要的晚期炎症介质    已有研究表明细胞外的HMGB1能引起炎症反应，参与感染和炎症的病理进程［5，8-9］。一些研究表明对于与脓毒症有关的致死性多器官功能衰竭，HMGB1是一个必需的重要的中间介质［9-11］。    在TNFα浓度峰值出现以后使用抗HMGB1抗体，也可以保护小鼠免于死亡［5］，在炎症发生后24 h给予乙基丙酮酸盐(在体内试验中可抑制HMGB1产生的)，可以延长脓毒症小鼠模型的存活时间［8］，进一步证明HMGB1作为一个晚期炎症因子在炎症竞争性抑制实验结果发生、发展中发挥重要作用。这也提示HMGB1的窗口治疗期比其他早期炎症因子更宽。鉴于HMGB1是全身性炎症及脓毒症级联反应中的晚期关键炎症因子，且其治疗窗口期长，使得该分子成为防治全身性炎症及脓毒症措施中一个重要靶标。    3.2  目前针对HMGB1的抗炎制剂    首先报道的研究是，针对HMGB1的兔多克隆抗体，用于LPS诱导的内毒素血症中能有效地阻止内毒素血症导致的死亡，减缓内毒素引起的关节炎［12-14］。但HMGB1抗体并不能明显改变由LPS诱导的TNF、IL1β、IL8、MIP的表达水平［15］。这也说明HMGB1是一个独立的炎症介质。除了抗HMGB1抗体，目前还有两种不同的拮抗剂，HMGB1 A Box和乙基丙酮酸酯。目前，A Box的治疗作用已经在盲肠结扎穿孔模型和关节炎模型中得到评估［16］。这提示A Box蛋白具有潜在的治疗作用，但A Box是小蛋白或小肽，其半衰期短，需重复给药。在盲肠结扎穿孔模型中发现，乙基丙酮酸酯能减少小鼠死亡率，即使当腹膜炎发生后24 h，给予乙基丙酮酸酯仍能有效发挥作用。除了对这两类抑制剂进行完善外，还需发展新型HMGB1抑制剂。    3.3  结论及意义    研究表明，向培养的人单核细胞中加入纯化的重组HMGB1可以明显刺激细胞因子IL1β的释放，并且呈明显的剂量依赖性关系。本实验在成功构建、制备、鉴定、纯化重组人HMGB1蛋白及其6个突变体的基础上，应用激光共聚焦的方法筛选出能与THP1细胞膜上受体结合的突变体，结果提示M1～M6 6个突变体都能与靶细胞THP1细胞膜上受体结合。分别加入各突变体蛋白与靶细胞THP1共同孵育后收集上清液行ELISA检测IL1β含量，发现HMGB1 M4在6～8 h促炎作用较强，甚至大于阳性对照，其余各突变体均明显低于阳性对照组(P<0.05)，与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此经IL1β ELISA实验结果可初步筛选只与膜受体结合而不诱导炎症因子排除HMGB1 M4。竞争性抑制实验提示，2～6 h各突变体组细胞上清液中IL1β含量与阳性对照组均无明显差异，但6 h以后各突变体的作用呈现出了区别。在6 h以后加入HMGB1 M6组细胞上清液中IL1β含量明显高于阳性对照组，因此M6不能竞争性抑制HMGB1诱导IL1β的表达。其余各突变体蛋白和HMGB1蛋白与THP1细胞共同孵育后，于6 h以后上清液中IL1β含量有低于阳性对照组的趋势，尤其是HMGB1 M2，其IL1β水平于6、8 h两个时相点都显著低于阳性对照组(P<0.05)。从而获得了既能与天然HMGB1蛋白受体结合却没有致炎效应，能竞争性抑制HMGB1致炎效应的4种突变体：HMGB1 M1、HMGB1 M2、HMGB1 M3、HMGB1 M5。尤其是HMGB1 M2对HMGB1致炎效应的竞争性抑制作用最显著。因此，本实验有望研制出针对炎症晚期的新型的抗炎候选制剂。【参考文献】  ［1］ Abraham E, Arcaroli J, Carmody A, et al. 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