二氧化碳气腹对胃癌腹腔脏器种植转移的影响

二氧化碳气腹对胃癌腹腔脏器种植转移的影响作者：孙梯业 赵永亮 颜伟 余佩武    作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院普通外科、微创胃肠外科中心    【摘要】  目的 研究腹腔镜胃癌手术时CO2气腹对肿瘤腹膜及脏器转移的影响。方法 选用人胃癌细胞（MKN45）悬液1 ml（2×107/ml）注入裸鼠腹腔内，建立人胃癌细胞裸鼠腹腔种植模型。2周后，实验裸鼠分为2组：CO2气腹组（30只）和开腹组（30只）。7周后，探查肿瘤细胞腹膜种植及各脏器转移情况。结果 CO2气腹组有27只致瘤，其中8只发生戳孔种植，19只发生脏器转移；开腹组有26只致瘤，其中7只发生戳孔种植，19只发生脏器转移，两组差异无统计学意义（χ2=0.007,0.240,0.202,0.106,0.042,P>0.05）。结论 CO2气腹没有促进人胃癌细胞裸鼠腹腔脏器转移的发生，腹腔镜胃癌手术具有一定的安全性与可行性。    【关键词】  CO2气腹； 胃肿瘤； 转移　　Effects of CO2 pneumoperitoneum on the abdominal viscera metastasis and peritoneal implantation of gastric cancer cell line SUN Ti-ye, ZHAO Yong-liang, YAN Wei, YU Pei-wu. 　　Department of General Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China    【Abstract】  Objective  To study the effects of CO2 pneumoperitoneum on the abdominal viscera metastasis and peritoneal implantation of gastric cancer cell line MKN45 during laparoscopic gastric surgery. Methods  The gastric cancer cells metastatic model was established by injecting 1 ml （2×107/ml）human gastric cancer cell line MKN45 suspension into the caecum wall of 60 Balb/C mice. Two weeks later, the Balb/C mice were divided into CO2 pneumoperitoneum group （n=30） and laparotomy group （n=30）. All mice were sacrificed 7 weeks later to investigate the abdominal viscera metastasis and peritoneal implantation of gastric cancer cells. Results  Twenty-seven rats in CO2 pneumoperitoneum group were induced with tumor, including 8 with trocar port implantation and 19 with organ metastasis; 26 rats in laparotomy group were induced with tumor, including 7 with tracar port implantation and 19 with abdominal viscera metastasis, and the differences between the two groups had no statistical significance （χ2=0.007, 0.240, 0.202, 0.106, 0.042,  P>0.05）. Conclusions  CO2 pneumoperitoneum does not stimulate the metastasis of gastric cancer cells to peritoneum and abdominal viscera in Balb/C mice. Laparoscopic surgery for gastric cancer is safe and feasible.    【Key words】  CO2 pneumoperitoneum;  Gastric cancer;  Metastasis    目前，腹腔镜早期胃癌手术取得了与开腹手术相当甚至优于开腹手术的近、远期疗效［1-2］。但其手术的安全性正逐渐引起人们的重视。CO2人工气腹对肿瘤细胞戳孔种植及脏器转移的影响成为人们关注的焦点。本研究选用胃癌细胞株在长时间持续性气腹状态下， 观察CO2气腹对胃癌细胞裸鼠腹腔种植模型戳孔种植及腹腔脏器转移的影响，探讨腹腔镜胃癌手术的安全性与可行性。1  材料与方法　　1.1  实验动物    Balb/C（nu/nu）裸小鼠60只，雌雄各半，4～6周龄，体质量17～20 g。购自第三军医大学实验动物中心，在SPF条件下饲养。　　1.2  人胃癌细胞株MKN45    选取人胃癌细胞株MKN45（购自第四军医大学全军消化疾病研究所），在37 ℃、5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 U/ml链霉素的DMEM培养液培养，48～72 h换液1次。另准备培养瓶，内含DMEM 25 ml，作收集细胞用。　　1.3  人胃癌细胞悬液的制备    无菌操作，体外培养的MKN45生长80%融合时，用含0.025%胰蛋白酶、0.01% EDTA消化液消化1～2 min，倾出消化液，加入无血清DMEM洗涤，用吸管吹打重悬细胞，800 r/min离心5 min，0.9%生理盐水洗涤3次并计数，用0.9%生理盐水配成接种细胞浓度为2×107/ml的单细胞悬液，封闭瓶口，置于碎冰上，备用。　　1.4  建立人胃癌细胞裸鼠腹腔种植CO2气腹模型    无菌条件下，选用2.5%戊巴比妥钠腹腔麻醉后（1 μl/g），新洁尔灭酊消毒。取5 mm腹腔镜穿刺套管分别在大鼠左、右下腹置入腹腔，并于左下腹穿刺套管下2 cm处用注射器注入1 ml胃癌细胞液至大鼠腹腔内。右下腹穿刺套管连接气腹机，备有智能压力报警系统，一旦腔内压力高于设置压力，将自动报警、停止进气，直至压力处于安全状态。气腹机产生高流量气流（5 L/min），并持续补气，一旦漏气则自动充气至指定压力。最后从左下腹穿刺套管收集气体至一培养瓶作培养，以观察是否有胃癌细胞随气体逸出。具体实验装置见图1。　　1.5  动物分组    2周后，将实验裸鼠分为2组： （1）CO2气腹组（30只）：取剑突下0.5 cm处，切开皮肤0.2 cm，穿入7号针头连接CO2人工气腹机予CO2建立人工气腹，气腹压力为5 mm Hg （1 mm Hg=0.133 kPa），持续60 min后，拔除针头放出气体，全层缝合腹壁。（2）开腹组（30只）：取左下腹部进针，用注射器注入1 ml胃癌细胞液至大鼠腹腔内。　　1.6  观察指标    肿瘤种植7周后，2组裸鼠均脱颈法处死，行剖腹、剖胸术探查致瘤裸鼠胃癌细胞戳孔种植和腹腔各脏器肿瘤转移情况，取腹部正中切口、气腹戳孔及脏器标本行病理检查。记录戳孔种植或各脏器转移的裸鼠数量。　　1.7  统计学分析    所有资料输入SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，组间样本率的比较用χ2检验法或Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  CO2气腹组和开腹组裸鼠致瘤情况    实验裸鼠腹膜、胃、肝、肠和肾等脏器上可见息肉样肿物，大小不等，最大直径0.6 cm，数目一至数个，切面呈鱼肉状。CO2气腹组的30只裸鼠中27只致瘤，戳孔8只，胃9只、肝7只、肠27只和肾5只有转移瘤形成；开腹组30只中26只致瘤，戳孔7只，胃10只、肝5只、肠26只和肾4只有转移瘤形成。两组裸鼠致瘤率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1，图2。表1  裸鼠腹腔转移瘤戳孔种植及各脏器转移情况（略）　　2.2  裸鼠腹腔转移瘤的组织学特性    光镜下观察，细胞幼稚，分化差，形态特征为胞质少，核大、深染、多形性，细胞形状不规则，染色质丰富，核质比例高于正常，核分裂象多见；癌细胞呈团块状或不规则状排列，多呈集中分布，未形成腺样结构，浸润性生长，见图3。3  讨论    国内外许多学者建立了各种动物实验模型，包括肿瘤细胞实验动物的腹腔内、门静脉等，并对CO2气腹是否造成肿瘤细胞戳孔种植及脏器转移进行了研究［3-4］。当气体充入腹腔时，肿瘤细胞可呈雾化状态。这可能造成肿瘤细胞的戳孔种植。Wittich等［5］将不同数量的CC-531细胞注入供体小鼠腹腔后再随CO2气流进入受体小鼠腹腔，通过比较肿瘤在受体小鼠腹腔的生长情况发现，当肿瘤细胞数量a：肠（→）和腹膜（←）转移瘤结节； b：胃（→）和肝（←）转移瘤结节； c：肾转移瘤结节（←）； d：肝转移瘤结节（←）； e： 开腹组（→）、CO2气腹组（←）腹腔转移瘤结节； f：开腹组（→）、CO2气腹组（←）腹膜转移瘤组织为2×106时，受体小鼠腹腔无肿瘤生长；当肿瘤细胞数量为1.6×107时，受体小鼠腹腔出现肿瘤生长。因而得出结论，在腹腔镜手术中，CO2气腹条件下，肿瘤细胞的雾化状态是存在的，但腹腔内要有极高数量的肿瘤细胞，才能通过这个机制发生转移。CO2气腹条件下肿瘤细胞的雾化作用不是戳孔种植的主要原因［4］。    戳孔损伤以及CO2沿戳孔的泄漏人工气腹条件下，腹腔中气体的压力高于大气压，可有部分气体沿戳孔泄漏。这可能造成肿瘤细胞由气体携带而种植于戳孔损伤处。有研究将恶性肿瘤细胞注入充有CO2的小鼠腹腔后，根据戳孔损伤程度，以及有无CO2沿戳孔泄漏，分组观察其肿瘤细胞戳孔种植率的差别，证实戳孔部位组织的损伤和CO2沿着戳孔的泄漏提高了肿瘤细胞戳孔种植率。这提示我们在气腹条件下，脱落的肿瘤细胞的数量需达到一定程度才能通过肿瘤细胞的雾化状态发生肿瘤戳孔种植，手术操作等机械性因素可能是肿瘤戳孔种植的主要机制。所以，了解CO2气腹对胃癌戳孔种植及脏器转移的影响对于腹腔镜胃癌手术尤为重要。本实验将2×107/ml的MKN45细胞注入裸鼠腹腔建立胃癌细胞裸鼠腹腔种植模型，持续注入CO2气体，更接近于临床胃癌患者的转移情况，且致瘤率达到90%以上，裸鼠脏器转移率达到80%左右。    虽然人胃癌细胞悬液裸鼠腹腔转移率未达100%。但本实验采用接种后2周，再实验分组，最后统计各组致瘤裸鼠中戳孔种植和脏器转移的发生率，使得各组的数据具有较大的可比性。结果表明：裸鼠胃癌戳孔种植及脏器转移率在CO2气腹组和开腹组之间差异无统计学意义。由此得出：CO2人工气腹没有促进裸鼠胃癌的戳孔种植及脏器转移。本实验选用裸鼠为实验对象，虽然实验达到了将肿瘤细胞种植于腹腔建立异位胃癌模型的目的，却将人工气腹对细胞免疫功能的影响排斥在外。既往的实验结果已证明，同开腹手术相比，CO2人工气腹更多的保留了细胞免疫功能［6］。可见，腹腔镜胃癌手术是具有一定的安全性与可行性的。    当然，腹腔镜手术后肿瘤细胞种植转移还受其他方面因素的影响，其中包括外科医生的技术、肿瘤的生物学性状、戳孔局部内环境等。另外，还有机械性的因素，如肿瘤的穿透、反复的手术操作、戳孔的更换等［7］。通过戳孔保护和更为精细的操作等措施，腹腔镜术后戳孔种植率会大为降低。由于对腹腔转移瘤的具体测量较为困难，故本实验采用将发生戳孔种植或腹腔脏器转移的裸鼠数量作为观测统计指标。若能找到有效方法对转移肿瘤的大小、重量等具体指标进行统计分析，则更有价值。这将有待于下一步进行深入的实验研究。【参考文献】　［1］余佩武,罗华星.腹腔镜下胃癌D2根治术.消化外科,2006,5（4）:227-230.　［2］Lezoche E, Feliciotti F, Guerrieri M, et al. Laparoscop ic versus open hemicolectomy. Minerva Chir,2003,58（4）:491-507.　［3］石彦，钱锋，郝迎学，等.二氧化碳气腹对胃癌MKN-45细胞侵袭能力的影响.中华消化外科杂志,2007,6（6）:449-451.　［4］郑民华,王灏,李宏为.持续性CO2气腹影响胃癌细胞在腹腔镜切口种植的实验研究.中华普通外科杂志,2001,16（6）:356-357.　［5］Wittich P, Marquet RL, Kazemier G, et al. Port-site metastases after CO2 laparoscopy. Is aerosolization of tumor cells a pivotal factor? Surg Endosc,2000,14（2）:189-192.　［6］罗华星,余佩武,王自强,等.腹腔镜辅助下胃癌根治术对机体免疫功能的影响.第三军医大学学报,2005,27（9）:910-912.　［7］Scheidbach H, Schneider C, Hügel O, et al. Oncological quality and preliminary long-term results in laparoscop ic colorectal surgery. Surg Endosc,2003,17（6）:903-910.