Wnt1诱导分泌蛋白1在直肠癌中的表达及其临床意义

Wnt1诱导分泌蛋白1在直肠癌中的表达及其临床意义作者：田超 周总光 孟文建 李立 于永杨 杨烈 雒洪志 周宾    作者单位：610041 成都，四川大学华西医院消化外科实验室    【摘要】  目的 定量检测Wnt1诱导分泌蛋白1(Wnt1 induced secreted protein1，WISP1)基因在人直肠癌及远端正常直肠组织中的表达，为进一步研究该基因功能提供线索。方法 提取人直肠癌及癌旁正常直肠组织总RNA，采用实时RTPCR分析WISP1的表达，再对PCR结果进行分析。结果 WISP1 mRNA在直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常直肠组织，差异有统计学意义(P<0.05)。WISP1的表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移等因素有相关性。结论 WISP1基因的异常表达可能与直肠癌的发生、发展有关，有望成为直肠癌诊断预后的标志物和治疗的新靶点。    【关键词】  Wnt1诱导分泌蛋白1基因； 直肠肿瘤； mRNA　　Expression of Wnt1 induced secreted protein1 in rectal cancer and its clinical significance TIAN Chao, ZHOU Zongguang, MENG Wenjian, LI Li, YU Yongyang, YANG Lie, LUO Hongzhi, ZHOU Bin.Department of Digestive Surgery and Microcirculation, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China    【Abstract】  Objective  To provide basis for further study of Wnt1 induced secreted protein1 (WISP1) gene by quantitatively detecting its expression in rectal cancer tissues and distal normal rectal tissues. Methods  Realtime RTPCR was used to detect the expression of WISP1 mRNA in 86 samples of rectal cancer tissues and distal normal rectal tissues. Results  The average level of WISP1 mRNA expression in rectal cancer tissues was 7.744 times than that in normal rectal tissues, with statistical significance (P<0.05). The level of WISP1 mRNA expression was correlated with tumor differentiation, Dukes stage and lymph node metastasis. ConclusionsThe abnormal expression of WISP1 gene may play an important role in the carcinogenesis and development of rectal cancer. WISP1 may be helpful for prognostic evaluation and gene therapy in rectal cancer.    【Key words】  Wnt1 induced secreted protein1 gene;  Rectal caner;  mRNA    结直肠癌的发生、发展是多基因，多事件积累的结果。通过多年来的研究发现Wnt1信号传导途径异常激活参与了人类结直肠癌的发生［1］。Pennica等［2］研究表明Wnt1诱导分泌蛋白1(Wnt1 induced secreted protein1，WISP1)是Wnt1信号通路的下游靶基因之一。本实验采用实时RTPCR方法检测直肠癌中WISP1 mRNA的表达，为深入研究WISP1基因与直肠癌的发生、发展提供线索。1  材料与方法　　1.1  标本取材    收集四川大学华西医院普外科2003-2004年确诊的86例直肠癌患者资料，其中男44例，女42例。各病例分别取直肠癌组织以及相邻远端正常直肠黏膜组织。组织在离体30 min内取材， 并于液氮速冻置于-70 ℃冰箱保存备用。所取标本均经病理检查证实。　　1.2  主要试剂    逆转录酶MMLV为Takara公司产品； Trizol试剂为Gibco公司产品； DEPC、 DNaseⅠ、 RNase为Sigma公司产品；引物和探针由Takara公司合成。　　1.3  总RNA提取及逆转录反应    按RNA抽提步骤用Trizol抽提组织中总RNA，紫外分光光度法测定260 nm和280 nm的吸光度(A值)， 甲醛变性凝胶电泳观察其完整性， 只有A260/A280在1.8～2.0，28S/18S在2左右的样本才进入下一步的实验。用逆转录酶MMLV将RNA逆转录成cDNA。　　1.4  实时RTPCR反应    以Primer Express TM 1.0软件设计引物及探针序列。目的基因WISP1上游引物5′CCACCGGGGCCTCTACT3′，下游引物5′CCACACCGACCACCTGT3′，探针5′FAMCTATTGCGTACCTCGGGCGGTCTAMRA3′。内参照GAPDH上游引物5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′，下游引物，5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′，探针5′FAMACCACAGTCCATGCCATCACTAMRA3′。RTPCR条件：降解程序95 ℃5 min；扩增和定量程序95 ℃20 s，60.5 ℃30 s，72 ℃30 s；循环50次。　　1.5  扩增效率及产物分析    取目的基因WISP1与管家基因GAPDH按1∶1、1∶5、1∶25、1∶125、1∶625稀释成5等份，进行PCR扩增。利用REST软件对扩增结果分析，分别计算WISP1和GAPDH扩增效率及线性关系。RTPCR以CT为标准，根据文献［3］方法计算比值R。R＞1表示直肠肿瘤组织中WISP1基因表达上调。　　1.6  统计学分析    用相对表达软件工具XL［4］对RTPCR结果进行分析，揭示直肠癌组织及正常直肠组织两组间WISP1的表达是否有差异。利用SPSS 11.0软件包中Chi检验和秩和检验分析WISP1与临床病理指标之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  总RNA电泳检测及定量    电泳结果表明，提取的总RNA呈现清晰的18S与28S RNA条带，两者比例约为2∶1，表明具有良好的完整性。根据260 nm波长的光吸收值A260计算RNA的含量。A260/A280比值均>1.8，表明纯度符合要求。　　2.2  RTPCR扩增效率和线性关系    GAPDH及WISP1扩增效率分别是1.61及1.85。线性关系为r=1。　　2.3  WISP1基因在直肠组织中的表达    86例直肠癌样本中有56例过度表达，其中有17例直肠癌中的表达是正常直肠组织的1～5倍，有5例是6～10倍，有34例是超过10倍。REST结果显示在直肠癌中WISP1的平均表达水平是正常直肠组织的7.744倍，两组表达量的差别有统计学意义(P<0.05)，说明WISP1基因在直肠癌中的表达上调。　　2.4  WISP1基因水平与临床病理指标的关系    它与直肠癌的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移有关，与年龄、性别及CEA等临床病理因素无明显相关性(表1)。表1  86例直肠癌患者Wnt1诱导分泌蛋白1表达水平与临床病理资料的关系（略）3  讨论    结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年呈明显的上升趋势，发生机制至今仍不很清楚。Pennica等［2］研究表明WISP1作为Wnt1信号通路下游基因在结肠癌组织中过度表达，对结肠肿瘤的形成发挥重要作用。    本实验采用实时RTPCR检测WISP1的表达，其中56例患者表达上调，且在直肠癌中WISP1的平均表达水平显著高于周围正常的直肠组织。这提示该基因可能与直肠癌的发生、发展有关。WISP1表达水平与患者的分化程度、Dukes分期、淋巴结转移有显著相关性。随着分化程度的降低WISP1表达量逐渐升高。Dukes C、D期明显高于A、B期，差异有统计学意义。肿瘤恶性程度越高，WISP1表达率越高，发生直肠壁浸润、直肠壁淋巴结浸润和直肠周围淋巴结转移及腹腔转移的几率越高，提示直肠癌活检组织WISP1表达可作为临床判断大肠癌的恶性程度及预后的一项监测指标。在有淋巴结转移病例中WISP1表达阳性率(82.9%)显著高于无淋巴结无转移病例(52.9%)，它参与了直肠癌淋巴结转移，可作为一个新的预测结直肠癌转移潜能的生物学指标。内镜在诊断直肠癌同时检测WISP1表达，对诊断和术前预测直肠癌淋巴结,组织器官转移和直肠癌患者预后有意义。【参考文献】　［1］Miller JR. Wnt signal transduction//Alison M. The Cancer Handbook. London: Nature Publushing Croup,2002:195-208.　［2］Pennica D, Swanson TA, Welsh JW, et al. WISP genes are members of the connective tissue growth factor family that are upregulated in wnt1transformed cells and aberrantly expressed in human colon tumors. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(25):14717-141722.　［3］Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in realtime RTPCR. Nucleic Acids Res,2001,29(9):e45.　［4］Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for groupwise comparison and statistical analysis of relative expression results in realtime PCR. Nucleic Acids Res,2002,30(9):e36.