环氧合酶2对脓毒症大鼠免疫功能的影响

环氧合酶2对脓毒症大鼠免疫功能的影响作者：李斌 李玉民 石斌 李汛 周文策 朱晓亮 何明彦    作者单位：730000 兰州大学第一医院普外科    【摘要】  目的 研究环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）在脓毒症大鼠肝组织炎症反应中的表达及其对免疫功能的影响。方法 选择质量相近的Wistar大鼠54只，分为假手术组（6只）、脓毒症组（24只）、NS-398干预组（24只）。通过建立盲肠结扎穿孔脓毒症动物模型，用RT-PCR方法检测肝组织COX-2 mRNA的表达，ELISA法检测血清IL-6、IL-10、TNF-α水平，流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞的变化，同时观察肝脏病理变化。结果 （1）脓毒症组病理损伤重，NS-398干预组损伤减轻。（2）COX-2 mRNA：假手术组呈低表达，脓毒症组、NS-398干预组升高，但NS-398干预组较脓毒症组明显偏低。（3）IL-6：脓毒症组较假手术组和NS-398干预组明显增高（F=125.582，134.712，54.760，121.441，P＜0.05）。（4）IL-10：NS-398干预组高于假手术组和脓毒症组（F=39.064，34.382，51.115，8.174，P＜0.05）。（5）TNF-α：脓毒症组、NS-398干预组增高，但两组比较差异无统计学意义（χ2=5.600，6.162，7.136，7.200，P>0.05）。（6）CD4+/CD8+比值：NS-398干预组高于脓毒症组（F=17.448，15.055，30.068，64.210，P<0.05）。结论 COX-2在脓毒症中发挥重要作用，其作用途径可能是通过改变促炎、抗炎细胞因子之间以及CD4+、CD8+细胞之间的平衡，使机体免疫状态紊乱而实现的。    【关键词】  脓毒症； 环氧合酶2　　Effects of cyclooxygenase-2 on immunologic function of rats with sepsis LI Bin, LI Yu-min, SHI Bin, LI Xun, ZHOU Wen-ce, ZHU Xiao-liang, HE Ming-yan.　Department of General Surgery, First Affiliated hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China    【Abstract】  Objective  To study the expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） in hepatic inflammatory reaction and the effects of COX-2 on immunologic function of rats with sepsis. Methods  Fifty-four Wistar rats were divided into sham group （n=6）, sepsis group （n=24）, and NS-398 intervention group （n=24）. All rats were subjected to cecal ligation and puncture or sham operation. The expression of COX-2 mRNA in rat hepatic tissue was determined by RT-PCR, serum levels of IL-6, IL-10 and TNF-α were detected by ELISA, and percentage changes of CD4+, CD8+ cells by flow cytometry. The pathological changes of liver were observed at the same time. Results  （1） Severe pathologic injuries of liver were observed in sepsis group, while not in NS-398 intervention group. （2）The expression of COX-2 mRNA was up-regulated in sepsis group and NS-398 intervention group, and the expression value was higher in sepsis group than that in NS-398 intervention group. The expression of COX-2 mRNA was the lowest in sham group. （3） The level of IL-6 was higher in sepsis group than that in sham group and NS-398 intervention group （F=125.582, 134.712, 54.760, 121.441, P<0.05）. （4）The level of IL-10 was higher in NS-398 intervention group than that in sham group and sepsis group （F=39.064, 34.382, 51.115, 8.174, P<0.05）. （5）The levels of TNF-α in sepsis group and NS-398 intervention group were increased, and the difference between the 2 groups had no statistical significance（χ2=5.600, 6.162, 7.136, 7.200, P>0.05）. （6） The ratio of CD4+ to CD8+ was higher in NS-398 group than that in sepsis group （F=17.448, 15.055, 30.068, 64.210, P<0.05）. Conclusions  COX-2 plays an important role in the development of sepsis by changing the dynamic equilibrium between pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine and that between CD4+ and CD8+.    【Key words】  Sepsis;  Cyclooxygenase-2    脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是当今外科ICU首要死因［1］。环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是合成各种前列腺素的关键限速酶。研究表明脓毒症时COX-2的异常表达可导致脓毒症动物的免疫功能紊乱［2-3］。本文通过研究选择性COX-2抑制剂NS-398，与COX-2相关的炎性损害途径，探讨治疗脓毒症的新措施。1  材料与方法　　1.1  实验分组及给药方法    Wistar雄性大鼠54只，质量200～220 g，购自兰州大学动物实验中心。分为3组：假手术组（6只，实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后行开腹手术，不作模型诱导）；脓毒症组（24只，实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后建立模型）；NS-398干预组（24只，建立模型，实验开始前2 h腹腔内注射NS-398 10 μg/g）。脓毒症组、NS-398干预组根据取材时间不同又分为4组，每组6只。除干预措施不同外，其余喂养相同。　　1.2  动物模型的建立    盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型建立参照Flammand等［4］的方法。　　1.3  主要药物和试剂    NS-398购自美国Sigma公司；IL-6、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒购自上海郎卡公司；Trizol柱式RNA抽提试剂盒、AMV cDNA第一链合成试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；2×HotStart Taq PCR Mastermix试剂盒为北京天为时代公司产品；荧光标记的大鼠CD4和CD8抗体购自江苏联科生物技术有限公司。　　1.4  检测指标和方法    各组手术后3、6、12和24 h抽取大鼠门静脉血标本，用流式细胞仪检测CD4+、CD8+，ELISA法检测IL-6、IL-10、TNF-α；取肝组织观察病理学改变和进行RT-PCR检测。　　1.5  统计学分析    所得实验数据均用SPSS 13.0软件分析。数据满足方差齐性时，采用x±s描述，多组比较采用单因素方差分析方法，组间比较采用Bonfferoni法；数据不满足方差齐性时，采用中位数描述，多组比较采用Kraskal-Wallis秩和检验方法，组间两两比较采用调整检验水准后的Wilcoxon秩和检验方法。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  大体及电镜观察结果    （1）假手术组：肝脏无明显改变，红润，无血性腹水及坏死灶（图1）。（2）脓毒症组：可见不同程度的血性腹水，肠管扩张，并可见散布于盲肠、大网膜、肠系膜等处出血、坏死灶和皂化斑。肝脏大小无明显改变，颜色呈暗红色，表面可见散在的点状淤血。电镜下3 h可见肝细胞核基本正常，Diss间隙增宽，溶酶体增多，线粒体扩张（图2a）。6 h可见肝细胞核固缩、畸形，内质网减少，线粒体嵴断裂、髓鞘样改变，并有肥大细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润（图2b）。12、24 h可见细胞变形，血窦扩张，肝细胞核固缩、染色质呈块状、核膜不清，线粒体、内质网明显减少，内质网扩张、脱颗粒，胆小管闭塞、绒毛消失（图2c）。（3）NS-398干预组：除3 h外，其余各时间点可见少量血性腹水，肠管轻度扩张，盲肠处可见出血、坏死，无皂化斑。肝脏色泽稍暗，未见出血点。电镜下3 h与脓毒症组3 h变化基本相同。6 h Diss间隙增宽，核染色质边集，内质网减少，线粒体扩张，未见细胞浸润（图3a）。12、24 h可见溶酶体增多，内质网和线粒体仅见个别扩张，个别核膜不完整、染色质边集（图3b）。　　2.2  RT-PCR观察COX-2 mRNA在各组不同时间变化结果    肝组织中COX-2 mRNA在假手术组呈低表达（1040.82±2.77）；脓毒症组3 h表达明显增强（2064.04±6.78），到6 h达到高峰（3992.45±16.75），12、24 h仍呈高表达（2916.80±6.79，2237.80±7.42）；NS-398干预组COX-2 mRNA表达较脓毒症组显著降低，但是仍高于假手术组。见图4。　　2.3  不同时间IL-6、IL-10、TNF-α含量比较    脓毒症组IL-6、IL-10在3 h即明显增高，24 h达到高峰，各时段与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.05）；而TNF-α在术后早期即达到一个较高水平，24 h内变化不大。在NS-398干预组，IL-6虽有所增高，但各时段明显低于脓毒症组，12、24 h差异有统计学意义（P<0.05）；IL-10在各时段增高更明显，与脓毒症组比较差异有统计学意义（P<0.05）；TNF-α变化与脓毒症组相比虽有降低趋势，但是差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1  不同时间IL-6、IL-10和TNF-α在各组的变化（略）　　2.4  不同时间CD4+/CD8+比值变化    脓毒症组3 h CD4+/CD8+比值明显下降，与假手术组比较差异无统计学意义；6 h后进一步降低，24 h达最低。NS-398干预组在3 h可见上升，之后逐渐下降，24 h也降到最低，但是相同时间仍高于脓毒症组（P<0.05）。见表2。表2  不同时间CD4+/CD8+比值在各组的变化（略）3  讨论    脓毒症的发病机制相当复杂。它与炎症反应、凝血功能紊乱、神经及内分泌调节、免疫功能紊乱有关。研究认为，病理损害打击下的机体反应可同时出现特异性免疫系统抑制和非特异性炎症反应亢进，导致免疫平衡失控。无论是免疫亢进还是免疫抑制都对宿主不利，而恢复宿主内环境稳定，特别是恢复免疫机能稳定可能是解决脓毒症的方法［5-6］。    本实验采用与临床感染性腹膜炎最为接近的典型CLP制造脓毒症动物模型，结果显示脓毒症之后3 h肝脏即有明显病理变化，到24 h时病理损伤最严重。这提示脓毒症之后肝组织炎症反应剧烈，已造成一定程度的肝损伤。在脓毒症组3 h，CD4+/CD8+比值开始下降，24 h达到最低（0.21±0.05）；与此同时，血清中IL-6、IL-10和TNF-α增高，与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.05）。这表明脓毒症在造成肝损伤的同时，大鼠免疫功能出现紊乱。    研究表明COX-2可以使机体免疫功能失衡，可能是COX-2导致机体炎性损伤的一条重要途径。Yokoyama等［7］研究发现经选择性COX-2抑制剂NS-398预处理的小鼠心脏移植模型，IL-4和IL-10明显升高，并可诱导产生CD4+调节细胞。Dallal等［8］认为脓毒症新生鼠T细胞免疫功能抑制伴随IL-2产物的降低，而这种抑制可被NS-398改善。而COX-2作为合成前列腺素的关键限速酶，是否可能通过破坏免疫功能紊乱的途径引发脓毒症导致脏器损害并不清楚。我们观察到脓毒症早期大鼠肝组织COX-2 mRNA表达增高，24 h时仍呈高表达，而在假手术组并无升高。在COX-2 mRNA增高的同时，IL-6和TNF-α明显升高，CD4+/CD8+比值下降，肝脏病理损害加重。而当我们在使用选择性COX-2抑制剂NS-398后，COX-2 mRNA表达明显降低，肝脏病理损害明显好转，同时段CD4+/CD8+比值和IL-10较脓毒症组上调，而且IL-6降低（P<0.05）；TNF-α有下调趋势。COX-2在脓毒症中异常升高与肝脏损害加重、IL-6和TNF-α明显升高、CD4+/CD8+比值下降相伴随。这表明，COX-2增高后导致免疫失衡，最终使脓毒症损伤加重；而在抑制了COX-2的表达后肝脏损害减轻，免疫平衡有所恢复。这与Osterberg等［9］的研究结果基本一致。    近年逐步阐明，在脓毒症的发病过程中，机体并非处于一成不变的免疫激活状态，免疫抑制同样是脓毒症的共有特征，而脓毒症免疫抑制主要是由于淋巴细胞（包括B细胞和T细胞，特别是CD4+细胞）及树突状细胞凋亡加速的结果。脓毒症时，致炎因子和抗炎介质共同出现于血循环且浓度显著升高。目前已经确认对此过程有重要影响的促炎症细胞因子主要有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，抗炎症细胞因子如IL-4、IL-10等。这些介质相互作用，使促炎和抗炎反应达到平衡，以维护内环境的稳定。    COX-2在脓毒症中发挥重要作用，其作用途径可能是通过改变促炎和抗炎细胞因子之间以及CD4+、CD8+细胞之间的动态平衡，同时作用于特异性和非特异性免疫系统，使机体免疫状态更加紊乱，从而造成肝损伤。我们也观察到，NS-398对脓毒症肝损伤具有一定保护作用。【参考文献】　［1］Ikezoe T, Yang Y, Heber D, et al. PC-SPES: a potent inhibitor of nuclear factor-kappa B rescues mice from lipopolysaccharide-induced septic shock. Mol Pharmacol,2003,64（6）:1521-1529.　［2］Song AM, Bhagat L, Singh VP, et al. Inhibition of cyclooxygenase-2 ameliorates the severity of pancreatitis and associated lung injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283（5）:G1166-1174.　［3］Ejima K, Layne MD, Carvajal IM, et al. Cyclooxygenase-2-deficient mice are resistant to endotoxin-induced inflammation and death. FASEB J,2003,17（10）:1325-1327.　［4］Flammand FJ, Sibbald WJ, Girotti MJ, et al. Pentoxifylline does not prevent microvascular injury in normotensive, septic rats. Crit Care Med,1995,23（1）:119-124.　［5］严文伟,周总光,陈友琴,等.急性水肿性胰腺炎大鼠胰腺微血流变化和环氧合酶-2的表达.中华肝胆外科杂志,2004,10（4）:252-255.　［6］林洪远,盛志勇.脓毒症免疫调理治疗的新思路.中国危重病急救医学,2004,16（2）:67-69.　［7］Yokoyama T, Aramaki O, Takayama T, et al. Selective cyclooxygenase 2 inhibitor induces indefinite survival of fully allogeneic cardiac grafts and generates CD4+ regulatory cells. J Thorac Cardiovasc Surg,2005,130（4）:1167-1174.　［8］Dallal O, Ravindranath TM, Choudhry MA, et al. T-cell proliferative responses following sepsis in neonatal rats. Biol Neonate,2003,83（3）:201-207.　［9］Osterberg J, Ljungdahl M, Haglund U. Influence of cyclooxygenase inhibitors on gut immune cell distribution and apoptosis rate in experimental sepsis. Shock,2006,25（2）:147-154.