炎症性肠病动物模型的研究进展

作者：陈曦 杨世忠    作者单位：吉林大学第一医院消化内科，吉林 长春 130021

【关键词】  炎症性肠病；模型

　　炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病(Crohn病，CD)，其病因和发病机制尚不清楚，目前关于IBD 研究所取得的成果有相当一部分来源于对动物模型的研究，因而建立合适的动物模型显得至关重要。本文从IBD常用动物模型的主要机理，制备方法以及模型用途等方面作一综述。

　　1  乙酸（acetic acid）诱导的IBD模型   　　乙酸能增加血管通透性，激活激肽，促进纤维蛋白水解，干扰凝血机制过程，该模型主要是利用乙酸的这种毒性作用直接破坏结肠上皮，肠内细菌和毒素侵入肠壁，引起急性炎症反应，包括出血、水肿和典型的溃疡。动物可采用大鼠、小鼠、家兔和豚鼠等〔1〕。    　　造模方法：目前较为常用的是经肠腔灌注：大鼠禁食24 h后麻醉，将聚乙烯导管自肛门插入8 cm，然后注入4％～10％的乙酸1～2 ml， 使动物保持头向下的体位10～30 s，然后用生理盐水冲洗3次。造模后动物出现腹泻、大便隐血阳性及血便，3 d后达到高峰，结肠组织检查可见早期黏膜及黏膜下层水肿，隐窝脓肿，上皮固有层中弥散性中性粒细胞、淋巴细胞浸润，黏膜溃疡及部分或完全脱落，点状或片状出血，类似人类UC的急性期改变。上述病理改变一般在1～2 w后自愈。模型制作成功的关键是乙酸的浓度和作用时间，它直接影响病变的严重程度。    　　本模型制作方法简单，成本低，周期短，成功率高，重复性好，结肠产生的炎症及细胞因子的变化与人类UC相似，是目前实验性UC模型中应用最广泛的模型之一，主要用于UC急性炎症发作期药物治疗的疗效观察和评价黏膜愈合机制。缺点是其对结肠黏膜及血管造成化学性灼伤，与IBD致病因素差别较大，不能确切反映人类IBD免疫学机制和遗传学机制，亦不能反映IBD慢性、复发的特点，且自愈性强，不适合药物长期疗效观察。

　　2  三硝基苯磺酸(TNBS) 诱导的IBD模型    　　TNBS多与乙醇合用进行造模。该模型的机制是乙醇破坏肠黏膜屏障，TNBS作为一种有机酸半抗原渗入结肠组织，与组织蛋白等高分子物质结合，形成全抗原，使T淋巴细胞致敏，溶解了与半抗原结合的动物自身细胞，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应，随着组织的逐渐修复，可出现一系列肠壁的增生性改变。    　　造模方法：通常参考Morris方法〔2〕，将大鼠禁食24小时后麻醉，用长约15 cm，直径2 mm的硅胶管（或聚乙烯导管）由肛门轻缓插入8 cm处的肠腔内，快速（5 s内）注入50～150 mg/kg的30％～50％TNBS乙醇溶液。造模1 d后出现竖毛、懒动、厌食、大便次数增多，稀便，夹杂黏液或脓点等症状，3 d后达到高峰；1 w后大鼠出现大便隐血阳性及便血，肉眼可见组织黏膜水肿；2 w后组织黏膜出现坏死溃疡，随后出现组织增生，肠壁增厚，肠腔变小，病变可持续8 w左右，呈现慢性的炎症变化。该模型中TNBS的用量及浓度决定模型病变的轻重，一般以100 mg/kg为造模的最佳剂量〔3～5〕。    　　目前亦有用二硝基苯磺酸(DNBS)造模的〔6〕，其机制、造模方法、症状、症状高峰期出现时间、各个时间段的组织病理学变化与TNBS结肠炎相似，但DNBS毒性较小，价格相对也较低。    　　国外研究发现该造模方法在不同种属动物身上会诱导出不同的结肠炎模型，SJL/J小鼠是该模型的易感动物，诱导的模型为Th1型，即类似于人类的CD，Balb/C小鼠诱导出的模型则是Th1 和Th2混合型〔7〕。国内报道该模型大鼠的病理特点是组织逐渐呈一种慢性炎症变化，病程较长，各种炎症介质如PGF2、TXB2、LTB4、6ketoPGE1α、LTC4、PAF和IL等也发生明显变化，且有类似人类UC的大体病理及组织学改变，与人类UC相似〔8〕。亦有学者认为该模型类似于人类CD，如龙友明等〔9〕用TNBS建立大鼠模型，于第2周后见铺路石样征，甚至节段性炎症，认为该造模方法与人类CD相近。目前对该模型所属疾病报道不一。    　　TNBS造模法操作简单、经济实用、重现性好、造模时间短、病变持续时间较长，体现急性炎症向慢性转化的动态过程，是一种经典的动物模型，适合于对防治药物的筛选及其作用机制的研究。缺点是缺乏特征性急性期表现，且动物死亡率高。

　　3  硫酸葡聚糖钠(DSS) 诱导的IBD模型    　　DSS 是人工合成的肝素类多糖。DSS 模型的机制尚未阐明，可能与DSS影响DNA合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障、巨噬细胞功能障碍及肠道菌群失调有关〔10〕。肠道菌群可能与小鼠急性期炎症有关，而T细胞介导的免疫紊乱可能与慢性期肠道病损有关。本模型适用于多种动物，包括各种大鼠、小鼠、仓鼠以及豚鼠等，其中大鼠和小鼠的病变主要以直肠和左半结肠为主，而仓鼠和豚鼠的病变则在盲肠和右半结肠比较明显〔11〕。DSS诱导的炎症发病及严重程度与DSS浓度及动物种系有关。    　　造模方法：1985年，Ohkusa最先在仓鼠建立了DSS结肠炎模型〔10〕，其后Okayasu和Cooper等学者亦先后在BALB/C、C57、SW等小鼠建立了DSS急慢性结肠炎模型〔12，13〕。近年来，国内对DSS模型的研究越来越多，有学者根据Cooper的方法单次使用DSS建立急、慢性小鼠结肠炎模型〔14〕：①将分子量为5000的DSS溶于饮用水，配成5％ DSS溶液，让BALB/C小鼠自由饮用7 d，建立小鼠急性结肠炎模型；②让BALB/C小鼠自由饮用5％ DSS溶液7 d，然后饮用不含DSS的蒸馏水14 d，建立小鼠慢性结肠炎模型。结果:饮用5％DSS溶液7 d，BALB/C小鼠可发生腹泻、血便等症状，全结肠表现为以隐窝破坏为特征的多灶性小溃疡，伴中性粒细胞为主的急性炎症细胞浸润。停止饮用5％DSS溶液14 d后BALB/C小鼠的腹泻、血便等症状消失，全结肠表现为更局限的灶性小溃疡伴邻近上皮细胞再生、修复，以及突出的隐窝扭曲变形伴以淋巴、单核细胞为主的慢性炎症细胞浸润，与Okayasu和Cooper观察到的病变相似。该造模方法所致急、慢性期肠道病变均以远段结肠为重，而Cooper等用SW小鼠所建结肠炎模型的病变以近段结肠为重，进一步证明实验动物的种系对实验结果有较大的影响。该种造模方法耗时较以往多次循环使用DSS诱发慢性结肠炎明显缩短，值得推广应用。    　　DSS模型优点是简单易行，成功率高，重复性好，其症状、结肠肉眼病变和组织学改变均与人类UC相似〔12〕，且可人为地反复以DSS 刺激， 产生类似人类UC急性期和缓解期的变化，是研究UC发病机制和药物疗效较理想的模型。其缺点是价格较高，且由于动物饮水量无法精确控制，可能造成病变差异较大。

　　4  恶唑酮（OXZ）诱导的IBD模型    　　OXZ是一种较新的IBD造模方法，其机制尚未阐明，经免疫学研究发现，OXZ诱导的小鼠结肠炎模型为Th2细胞介导的体液免疫反应，细胞因子分泌以IL4过量生成为主，可被转移生长因子γ(TGFγ)所对抗，后者限制病变程度和病期〔15〕；也有学者认为是宿主的NK细胞识别的肠道抗原由 CD1 递呈， 后者可表达于树突状细胞、巨噬细胞、B 淋巴细胞和胃肠道上皮细胞， 从而导致肠道炎症。目前对这种模型的发病机制报道不多，有待广泛、深入研究。    　　造模方法：选用雄性SJL/J小鼠，乙醚麻醉后，经肛门插管深入距肛缘4cm处，缓慢注入恶唑酮150 μl(6 mg溶于50％乙醇中)， 随后将小鼠持续倒置30 s。一般造模2 d内出现懒动、腹泻、肉眼血便，4 d内有50％左右死亡，存活的小鼠于第7天左右病情好转，10～12 d基本痊愈，因此一般于造模后3 d处死动物，采集样本。    　　OXZ结肠炎模型区别于其他化学药物诱导的实验性结肠炎模型的主要特征有：①OXZ诱导炎症反应迅速，2 d内即达到高峰，出现消耗性血性腹泻，小鼠或死亡，或完全复原。②病变主要出现于远端结肠，近端结肠无明显炎症表现。炎症相对表浅，以淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞混合浸润为特征。③OXZ诱导的结肠炎是典型的Th2 型结肠炎。全身性使用抗IL4治疗可阻止结肠炎的发生〔16，17〕，IL12 治疗则无效，而抗转化生长因子β(TGFβ)治疗可导致更严重的炎症变化， 病变累及全结肠〔15〕。    　　该法制作简单，模型产生快，重复性好， 组织学特征、部位和细胞因子增殖情况均与人类UC相似，特别适合用于UC发病机制和新药开发的研究。缺点是疾病维持时间短，自愈性强，无慢性期变化，不适合模拟慢性复发性类型的研究。

　　5  二硝基氯苯(DNCB) 诱导的IBD模型    　　DNCB是一种小分子化学物质，它可以作为半抗原与组织蛋白结合成完全抗原，激发机体产生T细胞介导的细胞免疫反应〔18〕。最初是由Bick等于1964年在豚鼠建造〔19〕，以后Rabin等〔20〕对其进行了改进，并在兔身上成功制出UC模型。目前多在大鼠身上广泛应用。    　　制作方法：取成年大鼠，颈背部脱毛，用2％DNCB丙酮液(DNCB20 g，丙酮100 ml)涂于该处皮肤，每天1次，每次03 ml连续14 d，第15～18天用直径3 mm的导管经肛门插入结肠8 cm处，注入004 mmol/L(01％)DNCB乙醇(50％)液025 ml每天1次。该法自愈性较强，目前一般与乙酸连用，第1～15天处理同前，第16天同部位注入8％乙酸溶液2 ml，准确计时15 s后再用5ml生理盐水冲洗。造模后1～2 w即出现黏液脓血便或粪便稀溏症状，可持续16 w以上，有急性发作和慢性发展过程。乙酸作用后可见急性期病理表现。2～5 w后转为慢性期表现，溃疡愈合，但慢性炎症持续存在。    　　本模型成功率高，重复性好，病程长，病理学变化与人类相似，由迟发过敏反应引起发病，提示外源性抗原和机体自身抗原对免疫系统长期刺激可诱发IBD，为理想的免疫反应模型，有利于揭示IBD的免疫学发病机制。缺点是制作过程繁琐，周期较长，实验者需反复摸索DNCB的浓度、剂量、作用时间，且DNCB毒性大，动物死亡率高。

　　6  具有中医证候特征的IBD模型

　　61  脾虚型模型  王玉良等〔21〕用20％番泻叶浸剂灌服豚鼠，3 d后肛门注入5％冰乙酸01 ml，复制了辨证与辨病相结合的豚鼠脾虚型溃疡性结肠炎模型。实验组造模动物在灌服番泻叶3天后陆续出现便溏、纳呆、消瘦、畏寒、拱背、懒动、毛失光泽、精神萎靡等脾虚症状。冰乙酸对照组与空白对照组无上述症状，实验组和冰乙酸对照组注入冰乙酸后2～3 d出现黏液便、有的带血性分泌物，有的出现腹胀。造模第8天可见肠黏膜大面积水肿，不同大小的溃疡灶。病理切片可见黏膜、黏膜下层水肿，充血，大量炎性细胞浸润。黏膜上皮脱落，溃疡形成。本模型症状与临床脾虚型溃疡性结肠炎相符，病理改变与临床一致。

　　62  肝郁脾虚模型  顾立刚等〔22〕将大鼠每天不定时放入特制圆形箱内限制活动和饮食，并用胶布束绑大鼠后肢，每天约8 h，3 w后用5％醋酸1ml灌入结肠内，连续3 w。结果显示，模型组大鼠体重下降，粪便溏泄，肾上腺重量增加，胸腺重量下降；脾T、B淋巴细胞增殖反应能力明显下降；全血黏度升高，血中红细胞减少，白细胞增加，下丘脑单胺类激素如去甲肾上腺素、多巴胺、5羟色胺均升高。结肠黏膜炎细胞浸润、出血、水肿、溃疡等。以上各项均比单纯醋酸诱导组改变明显，用疏肝健脾方药治疗后上述指标改善明显。    　　顾立刚、王玉良等分别在乙酸模型的基础上建立了肝郁脾虚型和脾虚型UC模型，为更好的研究中医药治疗IBD的作用疗效及机制进行了有益的探索，但这类研究尚缺乏规范性及特异性指标，造模因素缺乏量化，有待进一步完善。

　　7  小结    　　IBD动物模型的制作方法多种多样，除上述常用方法外，还有自发性结肠炎〔23〕、多种免疫法〔24～28〕、转基因〔29，30〕、基因敲除〔31，32〕等模型，但由于目前IBD发病机理不清，尚无完全模拟人类IBD的模型。在今后的模型研究中，制造持续时间较长、造模时间短、具有自发、复发特点的动物模型，应是研究的重点。动物模型与IBD机制的研究必将互相推动，最终为治愈IBD提供有效的治疗手段。

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