COX2基因多态性与脑梗死的关系

　　作者：王凤,郑维红,马飞煜,邵为荣　　作者单位：厦门大学附属中山医院,福建 厦门 361004

　　【摘要】目的探讨COX2基因多态性与脑梗死的关系。方法选取年龄、性别匹配的脑梗死病例组177人，对照组135人,采用PCR技术和限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)的方法检测765G/C(rs20417)基因型。结果 COX2基因rs20417位点的等位基因和基因型在病例组和对照组的频数分布差异无显著性(P>0.05)。结论 COX2基因765G/C多态性与脑梗死的发病可能无关。

　　【关键词】 COX2;脑梗死;基因多态性;多态性;限制性片段长度

　　近年研究表明，炎症反应在动脉粥样硬化(AS)的发生与发展中起重要作用，前列腺素(PG)通过影响炎性反应、血小板功能和平滑细胞增殖等方面在AS中起着关键的作用〔1〕。环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸合成各种内源性PG的限速酶。在人体内主要存在COX1和COX2两种亚型。COX2为诱导型。生理情况下大多数组织中检测不到COX2表达，但可在炎症、细胞因子、激素等刺激因素的诱导下生成。本文通过研究与AS相关的基因可能发现脑梗死的易感基因，可为探讨脑血管病危险因素提供线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　依据1995年《全国第四届脑血管病会议》制定的诊断标准，选取2006年11月至2009年12月新发脑梗死患者177例。男121例，女56例，年龄50～75〔平均(61.27±10.02)〕岁。结合缺血性脑卒中低分子肝素试验(TOAST)病因分型法〔2〕，其中大动脉粥样硬化性脑梗死(LA)患者136例，男89例，女47例;小动脉闭塞性或腔隙性脑梗死(SA)患者41例，男27例，女14例。均经头颅CT或MRI证实，对于不符合TOAST分型中大动脉粥样硬化型及小动脉闭塞型的患者及严重肝肾功能不全的患者予以排除。同时选取135例体检健康者为对照组，男90例，女45例，平均年龄(60.05±11.34)岁，经病史询问无脑血管病史，部分经CT/MRI证实。排除房颤、合并周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病、大动脉炎、血液病、结核、恶性肿瘤、严重肝肾功能不全等。各组年龄、性别比较差异均无明显差异，具有可比性。

　　1.2 方法

　　清晨空腹经肘前静脉取血4 ml，肝素抗凝。按常规方法，经蛋白酶K及二十烷基硫酸钠(SDS)处理，酚氯仿抽提,无水乙醇沉淀提取基因组DNA。用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)方法进行基因型检测。PCR引物序列参照文献〔3〕，P1：5′CCGCTTCCTTTGTCCATCAG3′,P2：5′GGCTGTATATCTGCTCTATATGC3′， 进行扩增。①PCR反应体系为25 μl，其中含有TrisHCl(pH8.3) 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L， MgCl21.5 mmol/L，dNTP 200 μmol/L，引物0.4 μmol/L，1.0 U DNA聚合酶和30～50 ng基因组DNA。②PCR反应条件:预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1 min，然后55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃ 5 min。PCR产物用限制性内切酶(AciI)进行酶切,酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色，紫外灯下观察酶切产物并进行基因分型。根据限制性内切酶AciI酶切产生片段长度的不同,判定三种不同的基因型:GG型(188 bp、118 bp两条带),GC型(306 bp、188 bp、118 bp三条带),CC型(306 bp一条带)。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS13.0统计软件进行处理。基因型、等位基因频率和组间计数资料间比较采用χ2检验。计量资料数据采用x±s表示。两组均数间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 一般资料分析

　　患者组与对照组间年龄、性别构成、体重指数上无明显差异。与对照组相比，病例组的总胆固醇(TC)的差异无统计学意义(P>0.05)，血糖、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)均显著升高，而高密度脂蛋白(HDL)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 HardyWeinberg平衡检验

　　对脑梗死组和对照组单核苷酸多肽性(SNP)基因型进行平衡检验，结果表明它们的基因型频率分布没有偏离HardyWeinberg平衡(P>0.05)，表明所选择的研究人群基因频率能够代表群体的基因分布。

　　2.3 脑梗死组和对照组COX2基因rs20417位点基因型和等位基因的分布

　　脑梗死组COX2基因765G/C位点基因型G/G型、G/C型、C/C型分布与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。两组等位基因频率比较也无显著性差异(P>0.05，OR=1.416,95%CI:0.924～2.170)。见表2。表1 一般临床资料比较表2 COX2基因rs20417位点多态性在两组分布比较

　　2.4 脑梗死组不同亚型与对照组COX2基因rs20417位点基因型和等位基因的分布

　　LA组与对照组基因型频率比较无显著差异(χ2=2.743，P=0.254);G与C基因频率比较无显著差异(χ2=2.784，P=0.095)。SA组与对照组基因型频率比较无显著差异(χ2=0.442，P=0.802);G与C基因频率比较无显著差异(χ2=0.390，P=0.533)，见表3。表3 COX2基因rs20417位点多态性在不同类型脑梗死分布比较〔

　　3 讨 论

　　人COX2基因位于1q25.2～q25.3，长8.3 kb，含有10个外显子和9个内含子，其mRNA全长为4.1～4.5 kb。在基础条件下，COX2基因表达是高度受限的，COX2在正常生理情况下几乎不表达，但在许多病理条件下，由于内外环境的各种刺激，可使COX2呈过度表达。许多研究从各方面探讨了COX2与动脉粥样硬化的关系及COX2抑制剂对动脉粥样硬化的作用。COX2及其代谢产物对动脉粥样硬化的影响是双重的。一方面可引起白细胞内皮细胞黏附、促进血管收缩与血小板聚集和血栓形成等。另一方面，COX2表达增加可致内皮细胞合成释放一氧化氮(NO)和前列环素2(PGI2)增加，促使血管舒张、抑制血小板聚集和白细胞黏附。动脉壁内活化的巨噬细胞中COX2表达增加和PG产物可能通过很多机制促进动脉粥样硬化，包括增加血管渗透性，促进单核细胞黏附，诱导巨噬细胞化学趋化性，促进巨噬细胞迁移，刺激促炎因子白细胞介素6(IL6)产生，激活金属基质蛋白酶(MMPs)，促进平滑肌细胞迁移和增殖，增加细胞外基质合成、使白细胞和血小板活化以及炎症级联反应的扩大等〔4，5〕。

　　有研究显示，765G/C处于转录因子GC盒(Spl)结合位点，G/C突变使Spl不能与该位点结合从而降低COX2的表达〔6〕。765C等位基因与减少颈动脉内膜中层厚度(IMT)及使炎性细胞因子减少有关〔7，8〕。而Szezeklik等〔9〕研究显示，765C等位基因增加前列腺素的生物合成，该变异虽然破坏了Spl结合位点，但形成了另一个转录因子E2F的结合位点。有关COX2基因多态性和心脑血管疾病的关系逐渐引起人们的关注。研究对象主要集中在欧美国家，且研究结果不太一致，有些甚至是相反的。Colaizzo〔10〕等在112名缺血性脑梗死患者中发现，COX2 启动子G765C基因多态性与缺血性脑血管病相关，提示COX2基因是缺血性脑梗死的易感基因。Cipollone等〔11〕发现765C等位基因是冠心病和缺血性梗死的保护因子。而国外还有研究发现765C等位基因增加了非裔美国人梗死的易感性〔12〕。在韩国和美国人群中研究未发现765C等位基因与缺血性梗死的相关性〔13，14〕。关于中国人群中765G/C多态性与脑梗死的相关性尚未有报道。本研究选择汉族人群作为研究对象，对COX2基因765G>C多态性进行分析。探讨了COX2基因上潜在的功能性多态性位点765G/C与脑梗死的关系，发现COX2基因765G/C多态性与中国汉族人群中脑梗死无显著关联。当然，本文研究无法避免疾病研究固有的一些局限性，脑梗死病例样本量还不足够大，无足够的把握度以检测出低共显基因及其位点的微效作用，而且只对COX2的单一功能性多态位点进行研究。因此，有必要开展大样本量多基因多位点的研究以进一步揭示该基因在脑梗死发生发展中的作用。

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