瘦素激活MAPK和PI3K信号通路上调Bcl-2调控肺癌A549细胞增殖
发表时间：2014-08-22 浏览次数：1334次
肺腺癌是肺癌中最常见的肿瘤分型之一,最近几年其发病率在很多国家有逐渐升高的趋势[1]。瘦素为肥胖基因的蛋白产物,主要在脂肪组织中特异表达。瘦素与其受体结合后发挥生物学效应,包括机体抗氧化、维持能量代谢的平衡等[⒉3]。 近年来瘦素对肺癌的作用也日益受到研究者重视。血清高瘦素水平是小细胞肺癌的危险因子,瘦素基因多态性与肺癌易感性相关,而且,瘦素可作为一个生长因子,能够通过瘦素受体促进培养的人肺癌细胞株增殖。本课题组研究发现,瘦素及其受体在肺癌组织中高表达,并且其表达与淋巴结转移及肿瘤分期(TNM分期)相关。 通过构建慢病毒介导的靶向瘦素基因的小干扰RNA,沉默肺腺癌A549细胞中瘦素基因的表达后,细胞增殖受到抑制,凋亡明显增力萨。 然而,瘦素发挥此效应的确切机制尚未完全阐明。原癌基因Bc12是较为明确的调节细胞凋亡的基因,其蛋白具有拮抗凋亡蛋白的功能。Bc12过度表达时,DNA损伤修复失衡,使修复的细胞免于死亡,从而细胞增殖和凋亡失去平衡,最终导致肿瘤发生[⒎叫。与此同时,在多种人类肿瘤组织及肿瘤细胞系中存在着MAPK、PI3K/Akt信号转导通路的异常表达或异常活化尉;瘦素可通过MAPK/ERK和PI3K/Akt的途径促进前列腺癌、卵巢癌、乳房癌等细胞的增殖和浸润,这些提示通路调控的异常也与肿瘤关系密切。 基于上述资料,本实验通过观察瘦素对人肺腺癌A549细胞BcL2及少ERK1/2、少Akt等表达的影响,初步探索瘦素促进肺腺癌细胞生长的作用机制。 1材料与方法 1.1主要试剂人瘦素购于R⒏D公司;兔抗人BcⅡ单克隆抗体、兔抗人M2/p狃MAPK(ERK1/2×Thr202/Tyr2o4)单克隆抗体、兔抗人ERK1/2磷酸化(Tll1202/Tyr2o4)单克隆抗体、兔抗人Akt抗体、兔抗人Akt(Ser473)磷酸化抗体购于CellSignalingTechno1ogy公司;GAPDH抗体购于BloworldTechnol。gy公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司;A549细胞系由南京医科大学第一附属医院胸外科崔飞博士惠赠;DMEMF12培养基购自Hyclone公司;0.25%胰酶EDTA购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;DCA显色试剂盒、RIPA裂解液(强)购自碧云天科技公司。 1.2细胞培养从液氮罐中取出人肺腺癌A549细胞,常规方法复苏,重悬细胞,培养于含100U/ml青霉素、100酽L链霉素的10%胎牛血清DMEM培养基,按每孔1×106个细胞接种至6孔板,置37℃、5%C02培养箱培养。隔天换液,3d传代。 1.3细胞处理在所有实验过程中,细胞需无血清饥饿处理24h。然后用瘦素干预细胞2茌h或者其他预定的实验时间。阻断通道蛋白时,细胞要用阻滞剂(PD98059,40umol/L;LY294002,40umol/L)预处理3h,然后再用瘦素处理。 1.4Westernblottilabc从培养箱中取出细胞,弃去培养液,PBS洗涤3次,加入适量预冷的RIPA细胞裂解液(强),用细胞刮刮下细胞,转移人1,5mlEP管中,冰上裂解10min,然后4C14000r/min离心15min,上清转移至离心管中保存,取2ul测蛋白浓度。取各组蛋白50ul行15%SDSPAGE,电压60/80V,转膜240mA,42min,5%脱脂牛奶封闭2h。加入一抗,置于4C冰箱过夜,TBST洗膜10min×3次。加人辣根过氧化物酶偶联的二抗,室温孵育2h。TBST洗膜1Omin×3次,ECL化学发光,应用BIORADM°lccularImagerChemiTMXRs+凝胶成像仪分析,以GAPDH为内参。结果用⒏⒍RadQuano△One分析软件分析。 1.5统计学方法使用SPSS16.0统计软件进行分析,实验数据采用均值的单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1瘦素促进肺腺癌A549细胞Bc12蛋白的表达取对数生长期细胞,制成单细胞悬液,按每孔1×106个细胞接种于6孔板,贴壁生长后,换无血清培养基,继续培养~9dh,使细胞同步化。分别加入含瘦素浓度为0、5、25、50、100、300ug/L的培养基,其中无瘦素为对照组。继续培养24h,提取细胞蛋白。取⒛ul蛋白样本行Westcrnblotting。 结果 细胞在0~100ug/L范围内瘦素浓度越高,细胞内Bc·12表达逐渐增多,瘦素浓度达100ug/L时表达最明显(图1)。2.2瘦素激活MAPK或ERK1/2信号通路对数期生长的A549细胞接种于6孔板,贴壁生长后换无血清培养基,24h后分别加人含瘦素浓度为100ug/L的无血清培养基,无瘦素组为对照组,继续培养⒛h,提取细胞蛋白。Westernblotting检测ERK1/2及其磷酸化的表达。结果,瘦素主要影响MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平,如图2所示,瘦素作用A549后120min后开始激活ERK1/2,但作用30min后uERK1/2已被激活,到120min后显著激活,且各组与对照组之间相比差异有统计学意义(P(0.05)。用MAPK信号通路阻滞剂PD98059,联合或不联合PI3K信号通路阻滞剂LY2940O2,预先作用于A549细胞,结果艹ERK1/2明显受到阻滞,但是单独应用LY294002,却没有阻断瘦素促进ERK1/2的活化作用(图3)。 这就说明,ERK1/2的活化不依赖于PI3K信号通路。瘦素对细胞表现出的抗凋亡活性可能通过激活不同信号通路来完成。 2.3瘦素激活PI3K/Al【t信号转寻通路PI3K信号通路在细胞增殖、转化和肿瘤形成等方面发挥着重要的细胞内信号传导的作用。PI3K信号通路可能参与了瘦素对细胞发挥抗凋亡活性的过程。磷酸化的Akt表达水平可以作为瘦素激活了这一通路的可靠指标。瘦素作用AM9细胞,15min后可激活Akt和少Akt,并随着时间的延长,活性逐渐增强,各组与对照组相比差异有统计学意义(图4)。 2.4MAPK或PI3K抑制剂降低A549细胞抗凋亡的活性用PD98059(40um°l/L,DMSO3·8uD、LY294002(40umol/I',DMS07.6uD预处理细胞,检测两信号通路介导的瘦素抗凋亡的活性。瘦素(100ug/I')显著促进细胞Bc12的表达;无论是MAPK通路阻滞剂还是PI3K通路阻滞剂都不能影响Bc12的表达水平;但用2种阻滞剂预先处理细胞3h,在瘦素联合应用任何一种阻滞剂的情况下,Bc12的表达降低,尤其当2种阻滞剂同时应用时,其表达下降最明显(P<0.05)。 因此, 瘦素发挥抗凋亡的活性,可能是通过MAPK和P13K依赖的信号通路所介导的。3讨论肺癌尤其是肺腺癌病程进展迅速,病死率高,严重危害着人类健康。许多研究发现瘦素对子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生、发展具有明显的促进作用。 因此,了解瘦素与肺癌之间的作用及其相关机制很有必要。 本课题组相关实验证明瘦素可以促进肺腺癌A549细胞的增殖,抑制其凋亡,但是具体作用机制仍不是很清楚。已发现Bc12基因及其表达的蛋白可以抑制多种组织细胞的凋亡,延长细胞寿命;MAPK和PI3K信号通路与癌细胞的增殖均相关。 基于此,本实验用不同浓度的瘦素处理细胞后,发现肺腺癌细胞中存在Bc12蛋白的表达,且BcL2的表达明显高于未经瘦素处理的细胞,并随着瘦素作用浓度的增加,表达逐渐增强,且在高浓度(100ug/L)瘦素处理后肺癌细胞表达最明显(P(0.01)。 由此表明瘦素促进肺癌细胞增殖的作用与细胞凋亡失平衡有关。而经过高浓度瘦素(100ug/L)作用不同时间段的细胞后,瘦素促进了ERK1/2、Akt的活化,并发现ERK1/2的磷酸化过程不依赖于PI3K通路的激活。由此假设:瘦素作用于抗凋亡基因Bc12来促进肿瘤的增殖可能是通过激活MAPK通路、PI3K通路来完成的。于是,通过2种信号通路的抑制剂将其阻断,观测细胞Bc12的表达变化,结果任何一种通路阻断剂都可以降低Bc12的表达(P<0。05),且2种通路阻滞剂共同应用时阻断效果最明显。 综上所述,瘦素在肿瘤进程的两大关键因素——细胞增殖凋亡失衡和细胞信号转导异常中都有一定的作用。瘦素促进肺癌细胞增殖,其作用机制可能是通过MAPK和PI3K通路的过度激活,导致下游靶基因Bc12的过度表达,使细胞抗凋亡的效应增强,从而促进肺癌细胞过度增殖。而具体的作用位点及作用模式仍需要大量的实验加以完善。 这一研究对进一步了解肺癌的发生发展机制及寻找较为有效的分子靶向治疗方法起着十分重要的作用。 参考文献 Hanagiri T,Baba T,So T. Time trends of surgical outcome in patients with non-small cell lung cancer[J].{H}JOURNAL OF THORACIC ONCOLOGY,2010.825-829. Macrea M,Martin T,Zagrean L. Role of leptin as antioxidant in obstructive sleep apnea:an in vitro study using electron paramagnetic resonance method[J].Sleep Breath,2012. Dardeno TA,Chou SH,Moon HS. Leptin in human physiology and therapeutics[J].{H}Frontiers in Neuroendocrinology,2010.377-393. 承柯伟,冯源. 瘦素与肺癌关系的研究进展[J].{H}医学综述,2011,(19):2932-2935.doi:10.3969/j.issn.1006-2084.2011.19.018. 金俊霞,冯源,郑肇巽. 瘦素及其受体在肺癌中的表达[J].{H}江苏医药,2008,(3):217-219.doi:10.3969/j.issn.0253-3685.2008.03.001. 承柯伟,孙月雯,岳静静. 靶向瘦素基因的siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响[J].{H}国际呼吸杂志,2012,(4):249-255.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2012.004.003. Murphy KM,Streips UN,Lock RB. Bcl-2 inhibits a Fasinduced conformational change in the Bax N terminus and Bax mitochondrial translocation[J].{H}Journal of Biological Chemistry,2000.17225-17228. Jiang H,Xia D,Wu LJ. Inhibition of Bcl-2 enhances the efficacy of epirubicin chemotherapy in PC 3 prostate cancer cells[J].{H}Chinese Medical Journal(Engl),2011.4018-4021. Jeon BS,Yoon BI. Altered expression of cellular Bcl-2 in the progression of hamster cholangiocarcinogenesis[J].{H}SCIENTIFICWORLDJOURNAL,2012.385840. Mu N,Zhu Y,Wang Y. Insulin resistance:a significant risk factor of endometrial cancer[J].{H}Gynecologic Oncology,2012.751-757.
