甲型H1N1流感病毒的流行病学特点分析

　　2O09年初新型甲型HlN1在多个国家暴发流行并在我国迅速传播开来,严重影响了人们的身体健康[1]。我院应用实时荧光定量PCR检测系统对2009年6月至2010年5月采集的3287例疑似病例标本进行检测,在排除季节性H1N1流感病毒的基础上筛选甲型H1N1流感病毒,进而分析本地区的流行病学特点,掌握其发病规律,以便今后更好地开展防治工作。　　1材料与方法　　1.1试剂RNA提取试剂盒(CatdogNo.52904/52906)、无水乙醇、70%乙醇、阡巯基乙醇均由北京市疾病预防控制中心提供。　　1.2仪器实时荧光定量PCR检测系统、微量离心机、漩涡振荡器、台式冷冻离心机、生物安全柜等。　　1.3病毒核酸提取　　1.3.1CarⅡerRNA的配制每管CarⅡerRNA为310ug,用310ulAXˉE使其充分溶解,制成1酽I~储存液,56ul/管分装,于-20C冻存。每管储存液冻融不得超过3次。试剂盒中的AVI'使用前应根据说明书配制。依据提取样本数,配制相应体积的AVL,加人相应体积的CarⅡerRNA储存液,可2~4C存放48h。试剂盒中的AW1、AW2使用前按说明加无水乙醇。　　1.3.2样本处理在生物安全柜内,取出样本在漩涡振荡器上振荡15s,使咽拭子上样本充分溶解于采样液中,静置待用。　　1.3.3核酸提取生物安全柜内取1,5mlEppendo,·f管,加560ulAVI'后,取样本140ul,加入560ulAVI'中,于混悬仪上振荡混匀15s。室温静置10min,加560ul无水乙醇,于混悬仪上振荡混匀15s,8000r/min离心1min。从试剂盒中取出带滤膜的离心柱,将上述混合液吸630ul到滤柱中,8000〃min离心1min,弃收集管中的离心液于2%次氯酸钠消毒缸。滤柱放到新的收集管上,再吸630ul混合液,到滤柱中,8000r/min离心1min,弃收集管中的离心液。加入500ulAw1,8000〃m“离心1min,弃收集管中的离心液,滤柱放到新的收集管上。加人500ul灬v2,13ooo〃min离心3min,弃收集管,滤柱放到新的收集管上。13000r/min离心1min,弃收集管,将滤柱放到新的1,5mlEppendo1·f管上,加30~50ulAVE,室温静置1min。8O00r/min离心1min,弃滤柱,将收集的RNA放在-20C以下保存备用。　　1.3.4实时荧光定量PCR扩增在25ul反应体系内进行PCR扩增,引物工作浓度为40um。l/L,探针工作浓度为10umol/L,按试剂盒说明书配好反应体系,吸取5ul第一种样本到所有标记这种样品的孔中。每个样品的RNA提取物通过各自的引物和探针进行检测:InfA、swFluA、Swinem(swH1)和RNaseP。RNaseP引物和探针作为内部阳性对照,引物设计见表1。对于每一个过程中的所有引物和探针,均设立无模板对照和阳性模板对照。人类样本对照提供了次级阴性对照,以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。R孓PCR扩增反应条件为:48C,30min;95C,2min;95·C,15s;60·C,30s.　　1.4结果判读方法探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。在37个循环处或者37个循环之前,所有的临床样本的RNaseP反应曲线都应该超过阈值线。在40个循环之前,PTC反应的InfA、swFluA、swH1和RNaseP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效,应进行重复实验。具体判读方法见表2。　　2结果　　我院检测的3287例疑似病例中,甲型流感患者共计1039例,检出率为31.61%,其中甲型H1N1流感患者179例,总检出率为5,45%。20O9年10月为甲型H1N1流感的发病高峰期,2009年6月至2009年10月检出率呈骤然上升趋势,由0.00%升至15.36%,x2线性趋势检验比较差异有统计学意义(P(0,01);2009年10月至⒛09年11月检出率呈急速下降趋势,由15.36%下降至6。82%,x2线性趋势检验比较差异有统计学意义(P<0.01);⒛09年11月至2009年12月检出率虽略有上升但x2线性趋势检验比较差异无统计学意义(P)0,05);2009年12月至⒛10年3月检出率继续持续下降至0.38%,x2线性趋势检验比较差异有统计学意义(P(0.05);2010年3月至2O10年5月检出率略有上升,但x2线性趋势检验比较差异无统计学意义(P)O,05)。具体数据见表3和图1,2。　　3讨论　　2009年暴发的甲型H1N1流感(猪流感)大流行曾肆虐全球,疫情蔓延迅速,让人记忆犹新,因此我们应当居安思危,适时地再次审视甲型H1N1流感的流行病学特点,掌握其发生、发展规律9加强急性呼吸系统传染病的防治。甲型HlN1流感病毒属于正黏病毒科甲型流感病毒属的线状单股负链RNA病毒,有囊膜呈球形或细丝状,脂质囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白。其基因组结构和蛋白质组成与普通流感病毒基本相同,基因组大约为13.6kb,由大小不等的8个独立片段组成,编码11种蛋白(PB2、PB1、PB1—F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2)[23]。该病毒传染性强,易导致群集急性发病,易感人群多为青少年,临床表现为阵发性咳嗽、咳白色稀薄痰、发热、咽痛、咽部充血及扁桃体肿大,大部分病例的白细胞总数正常或降低,约一半患者嗜酸粒细胞下降,多伴有低钾血症。甲型H1N1流感目前主要的确诊方法为病毒核酸检测法[4],采用实时荧光定量PCR检测可疑病例的咽拭子、鼻拭子或气管抽取物可较为准确地检测出甲型H1N1流感病毒核酸。　　1918年,猪流感首次被认为是与人流感相关的疾病E°l,当时共有5亿人被感染,2100万人死亡,其在春季以温和流感出现,而秋季再发时以高致病性流感出现,这与我们观察的此次甲型H1N1流感的发生过程相似,x2线性趋势检验结果显示2009年10月(人秋后)甲型H1N1流感病毒检出率(15.36%)远高于其他月份(P<0,01)。在全部3287例疑似病例中,以感染普通甲流患者为主,共有1039例(占31.61%),甲型H1N1流感混在其中(占5.54%)。　　本地区出现甲型H1N1流感的时间是在⒛09年8月,之前几月均未检测出甲流感染。这可能是由于本地区处于北京市的郊区,空气环境比较好,夏天气候炎热,并且人口密度相对较低,流动人员相对少一些,甲型H1N1流感没能传播到本地区。2O09年8月至’009年10月,本地区甲型流感疑似患者、普通甲流患者及甲型H1N1流感检出率均呈直线上升,⒛09年10月达到传播的高峰,普通甲流患者感染在59,86%,甲型H1N1流感由最初的0.69%上升至15,36%,这是由于本地区外围疫情加重,我院收治患者类型由早期的输人性病例为主,发展为后期的本地发病病例占多数。　　2009年11月至2O11年1月间,因天气渐为寒冷,人们的户外活动减少,甲型H1N1流感感染较⒛09年1O月呈明显下降趋势。2010年2月至2010年5月,虽然气候转暖,但甲型H1N1流感病毒传播并未出现明显回升趋势,相反~9O10年2-5月仅检出甲型H1N1流感患者6例,检出率仅为0,73%(6/823),主要是因为人们对流感病毒的认识加强,采取了有效的防范措施,并且新型流感疫苗的研发和使用已逐步显示出其应有的效益。　　综上所述,2009年的甲型H1N1流感病毒的传播有明显的地域性和季节性,病死率较低,采取有效的防范措施可以相对控制甲型H1N1流感病毒的传播,但从流感大流行的历史来看,出现第二波大流行并非是不可能的,而且危害比第一波多要大,因此了解其流行病学特点后,我们应在日常的医疗工作中特别是在流感高发季节加强预防流感的卫生常识的宣教工作,并加紧研发更有效的新型疫苗。　　参考文献　　Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team,Dawood FS,Jain S. Emergence of a novel swineorigin influenza A (H1N1) virus in humans[J].{H}New England Journal of Medicine,2009.2605-2615.　　张超颖,白章红. 2009甲型H1N1流感病毒特性和检测方法概述[J].{H}上海畜牧兽医通讯,2009,(5):142-144.doi:10.3969/j.issn.1000-7725.2009.05.031.　　麻粉莲,李引乾,郑丽舒. 人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化[J].{H}中国生物制品学杂志,2009,(3):221-225.　　Carr MJ,Gunson R,Maclean A. Development of a real-time RT-PCR for the detection of swine-lineage influenza A (H1N1) virus infections[J].{H}Journal of Clinical Virology,2009.196-199.　　Taubenberger JK,Morens DM. 1918 Influenza:the mother of all pandemics[J].{H}EMERGING INFECTIOUS DISEASES,2006.15-22.　　Watson R. Swine flu could come back in more virulent form after summer,European experts say[J].{H}BMJ:British Medical Journal,2009.b1792.　　Michaelis M,Doerr HW,Cinatl J Jr. Novel swine-origi(n) influenza A virus in humans:another pandemic knocking at the door[J].{H}Medical Microbiology & Immunology,2009.175-183.