23价肺炎球菌多糖疫苗刺激人气道上皮细胞hBD-2表达的研究

　　细菌对传统抗生素的耐药性是当今临床医学面临的全球性难题。发展新的抗感染战略势在必行。内源性抗菌肤是动、植物固有免疫系统的重要介质，能够杀死金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和嗜血杆菌等大多数病原微生物，而且对霉菌、厌氧菌、螺旋体、分枝杆菌以及包膜病毒如流感病毒、艾滋病病毒等均有很强杀伤活性，在哺乳动物(包括人)中被称为防御素。防御素一2(hBD-2)是第1个发现的可诱导表达的人类防御素，主要表达于各种皮肤组织、豁膜上皮细胞，不仅具有广谱的抗微生物活性.而且起着连接固有免疫和适应性免疫的桥梁作用2，是机体抵抗微生物人侵的重要屏障物质，在呼吸系统中也发挥着重要的防御病原微生物侵袭及抗感染免疫的作用。通过人工调控上调h13D-2在呼吸道中的表达，研究气道上皮细胞防御素的诱导表达及其机制.发挥其抗菌活性的治疗作用，不仅具有重要的理论意义，而且可能成为解决感染细菌耐药的新手段之一。本研究以人气道上皮细胞为研究对象，探索经23价肺炎球菌多糖疫苗刺激后hBD-2表达的变化，为hBD-2的人工诱导表达提供实验基础和理论依据。　　1材料和方法　　1.1材料主要仪器设各:ughtcyderPCR扩增仪(瑞士罗氏公司);紫外分光光度计(德国HP公司);6801酶标仪(MiniPrcltean);W⒊Ⅲ型卡片式暗盒、⒏oSenSC300凝胶图像分析系统(上海山富科学仪器有限公司)。　　主要试剂:逆转录酶MMI'V、TAQ酶(Promega公司);胎牛血清、DMEM/12培养基(Hyclonc公司);Thzol、引物(Invitrogen公司);DNAMarkerDL2ooo(TAKARA公司);NE—PERNuclearandCytoplaslnicExtractionReagents、IGHTSHIFTEMSAKIT及PMSF(美国PIERCE公司);SP9000免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司);兔抗人hBD2多克隆抗体(San佗Cruz公司);RTPCR试剂盒(北京鼎国生物技术公司);RIPA裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)。　　1.2方法　　1.2.1人原代气道上皮细胞培养参照相关文献及我们前期课题的研究基础Ⅱ],获取胸外科手术切除的人正常肺叶、段支气管,分离原代人气道上皮细胞进行体外培养。实验获得了同济大学附属东方医院伦理道德委员会的批准。　　1.2.223价肺炎球菌多糖疫苗刺激人气道上皮细胞原代人气道上皮细胞培养至铺满平皿后,用含0,125%胰酶/0.01%EDTA的消化液进行消化,传代加人6孔培养板,每孔按1×105细胞数加人,DMEM/F12无血清培养基培养,当细胞融合覆盖70%~80%培养皿后,进行细胞刺激实验。将⒛价肺炎球菌多糖疫苗加人培养平皿,每孔加入不同浓度,分别为0.00001mL、0.00005mL、0.0001mg/L、0.005mg/L、0.05mg/I'、0.5mg/L、1mg/I'、2mg/L、5mg/L,作用2h后,分别于6、12、24h提取细胞总RNA,离心收集上清液,用于检测hBD2。重复3次实验。　　1.2.3RTPCR检测hBD2mRMA表达用Thzol提取培养人原代气道上皮细胞总RNA,取2ug总RNA在下述20ul反应体系中逆转录成cDNA:5×RT-Buffcr4ul,°ligd(T)2,5umol/L,dNTPs5mmol/I',RNA酶抑制剂~9OU。70C预变性5min,然后加人M-MLV逆转录酶200U,再于42·C孵育1h,72C加热10min灭活逆转录酶。　　根据Genebank中hBD2cDNA序列(登录号为NM~004942.2),由上海之江生物科技有限公司设计合成引物,行PCR扩增,同时用PCR试剂盒里看家基因GAPDH引物为内参照(表1)。hBD2反应条件:预变性94C×3min;变性94C×15s,退火61C×2os,延伸72·C×3os,共10个循环,每循环降低1C;变性94C×15s,退火51C×20s,延伸72C×3os,共40个循环。内参照G幻VH反应条件:预变性94·C×3血n;变性阢C×15s,退火57C×~9Os,延伸72°C×30s,共30个循环。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。/1.2.4EL⒙A方法检测细胞培养上清中hBD2蛋白表达严格按照试剂盒说明书进行操作,将标准品原液稀释9个梯度,计算出标准曲线回归方程,建立标准曲线。取恰当疫苗刺激气道上皮细胞后的培养上清液,离心后上清液加人待测样品孔中进行EI'ISA检测,酶标仪在405nm处测定OD值,将样品光密度值代入标准曲线并乘以相应的稀释倍数,计算出hBD2蛋白浓度,最后得出相应含量。　　1.2.5抑菌实验PBS、正常培养基、23价肺炎球菌多糖疫苗(0.5mg/I')作用于培养的人气道上皮细胞,12h后收集培养上清液,经透析冻干浓缩后溶解。对数期大肠杆菌10ul稀释至500ul培养基中,均匀涂板晾干,放入无菌滤纸片,分别取上述3种浓缩上清液10ul滴加到滤纸片上,37·C过夜进行细菌抑制实验。　　1.3统计分析数据以勇±s表示。采用SPSS10,0统计软件进行统计,实验数据进行单因素方差分析,P(0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1人气道上皮细胞中hBD2mRNA的表达用人气道上皮细胞总RNA为模板所得到的R⒎PCR产物,经2%琼脂糖凝胶电泳检测为一条”7bp的条带,与预计扩增片段大小相符(图1~3)。　　应用凝胶成像系统对电泳所得hBD2mRNA条带进行灰度扫描并与相应GAPDH条带的灰度比较,得到其比值,将3次结果进行统计学处理。结果提示,23价肺炎球菌多糖疫苗不同浓度刺激气道上皮细胞2h,分别在不同时间点检测,6h后,各组人气道上皮细胞中hBD2mRNA的表达与对照组相比无明显变化,刺激12h、24h后,浓度大于0,5mg/I'的各组人气道上皮细胞中hBD2mRNA表达量较对照组明显升高(P<0.05),最高为对照组的2,16倍;但24h后各组hB△2mRNA表达量有所下降。　　2.2人气道上皮细胞培养上清中hBD2蛋白浓度23价肺炎球菌多糖疫苗以不同浓度刺激气道上皮细胞,在6、12、24h的不同时间点收集上清液,ELISA法检测hBD2蛋白浓度。作用6h后,各组细胞培养上清液中hBD2蛋白浓度与对照组相比无明显变化,刺激12h、24h后,浓度大于0.5mg/L的各组细胞培养上清液中hBD2蛋白浓度明显升高(P(0,05),最高为对照的1.94倍,但~9dh后各组hBD2蛋白浓度明显下降(表2)。　　2.3抑菌实验如图4所示,各培养上清浓缩液中,PBS无抑菌斑出现,正常培养基有淡而模糊的抑菌斑,23价肺炎球菌多糖疫苗有清晰的直径12mm的抑菌斑,具有一定的抑菌效果。　　3讨论　　hBD2有较强的杀菌活性,其杀菌机制主要是破坏细菌包膜,使细菌溶解,同时还具有诸如细胞毒性、趋化作用、调理吞噬作用等其他生物学活性。　　hBD2同溶酶体、补体、各种炎症因子等相似,属于固有抗感染免疫系统,与固有免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等相互作用,紧密联系,构成机体抵抗外界病原微生物感染的第一道防御屏障,并可进一步启动和调节适应性免疫[5]。hBD2在自然条件下表达水平极低或不表达,而当受到刺激诱导后,在各种组织黏膜细胞中的表达上调,发挥其抗菌和调节免疫的功能。其可诱导表达的特性为利用某种人工方式调控hBD2的表达提供了理论依据。诱导hBD2表达上调的因素主要包括炎症前细胞因子、微生物等,其中微生物则包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌以及病毒等。有实验显示不同微生物成分可诱导不同防御素分子的表达,而不同的刺激因素对hBD2的诱导也存在着明显的差异。　　Khsanaprakornkit等[6]的研究显示肿瘤坏死因子、梭形杆菌胞壁成分可快速诱导hBD2的表达(2~4h),而PMA则较慢(10h)。hu等L则认为白介素Iα、白介素1β和活的铜绿假单胞菌是最有效的诱导因素,而其他的细菌和细胞因子对hBD2的合成没有影响或影响很弱。　　虽然各种病原微生物都能刺激机体产生hB△2,但是直接用病原微生物刺激气道上皮细胞的研究仅限于体外细胞培养或者动物实验的水平。为了能进一步在体内进行研究,探索人工促进β防御素合成释放的方法并应用于临床,需要找到一种安全、有效,但又不失病原菌抗原特性的诱导剂,疫苗可能是比较合适的替代物。　　疫茴是一种生物制品,含有能刺激人体产生免疫力的有效成分,如微生物(细菌或病毒)本身或其组分、产物,无致病力,但仍然保持了微生物的免疫原性,使用安全、有效。疫苗的作用机制是疫苗被抗原提呈细胞识别后,促使树突状细胞增殖和分化,增强其抗原呈递作用,激活T细胞和促进B细胞成熟并向浆细胞转化,增强巨噬细胞及自然杀伤细胞活性,刺激白介素2等内源性免疫活性细胞因子的分泌和高效价广谱IgA、IgG等抗体的产生,从而改善细胞和体液免疫的失衡状态,杀灭各种医源性细菌。作为病原微生物有效免疫原性的替代物,疫苗具有刺激、诱导hB△2表达上调、促进hBD2产生的可能,进一步疫苗和hBD2两者可相互影响,产生协同效果,共同发挥抗微生物感染的作用。　　本课题实验结果显示,原代培养的人气道上皮细胞仅有少量hBD2的mRNA和蛋白表达,以23价肺炎球菌多糖疫苗作为诱导因素对其进行刺激,在一定的浓度和时间条件下,气道上皮细胞中hBD2mRNA的表达和培养细胞上清液中hBD2的蛋白浓度明显升高,⒛价肺炎球菌多糖疫苗(0.5mg/L)作用于培养的人原代气道上皮细胞12h后,hBD2mRNA和蛋白表达上调,24h后上调表达的程度虽然有所降低,但仍高于对照组。抑菌实验显示,23价肺炎球菌多糖疫苗刺激人气道上皮细胞后的上清液具有明显的抑菌效果。结果表明,病原菌疫苗可诱导上皮细胞表达hBD2,持续时间在12h后达到峰值,以后有所下降,提示hBD2在病原菌疫苗介导的免疫反应中有一定的辅助作用,据此推测病原菌疫苗可通过诱导hBD2的表达提高机体的抗感染免疫及杀菌能力,但作用持续时间较短。　　根据固有免疫的特点,可以推测为什么一定浓度的23价肺炎球菌多糖疫苗(0.5mg/L)刺激人气道上皮细胞后hBD2表达水平升高,且表现为一定程度的时间依赖性。病原菌疫苗作用6h后,受刺激的人气道上皮细胞尚处于即刻早期固有免疫阶段,故应答快速,但产生的hBD2量少。在作用12h甚至24h后,此时处于早期固有免疫阶段,hBD2继续得到释放,而刺激物浓度高于某一值的组别能够更加有效地刺激hBD2mRNA的表达和hBD2的释放,推测可能是因为人气道上皮细胞中的信号转导通路被激活,导致hBD2基因的活化,迅速合成了大量的hBD2,从而满足周围环境的需要。　　综上所述,一定浓度以上的23价肺炎球菌多糖疫苗刺激人气道上皮细胞,在短期内可能促进hBD2l·lRNA的表达和hB△2蛋白水平的增加,增强其天然抗微生物的作用。临床上可通过制各各种病原菌的疫苗来诱导防御素表达,提高机体的抗感染能力,减少对抗生素的过度依赖和使用。　　参考文献　　张继南,陈红霞. 抗菌肽及其应用研究进展[J].{H}生物技术通讯,2006,(4):669-672.doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2006.04.053.　　王猛,马艳平,刘永生. β-防御素研究进展[J].{H}安徽农业科学,2009,(8):3561-3563.doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2009.08.082.　　Goldman MJ,Anderson GM,Stolzenberg ED. Human beta-defensin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis[J].{H}CELL,1997.553-560.　　Temann UA,Ray P,Flavell RA. Pulmonary overexpression of IL-9 induces Th2 cytokine expression,leading to immune pathology[J].{H}Journal of Clinical Investigation,2002.29-39.　　Dommisch H,Winter J,Willebrand C. Immune regulatory functions of human beta-defensin-2 in odontoblastlike cells[J].{H}International Endodontic Journal,2007.300-307.　　Krisanaprakornkit S,Jotikasthira D,Dale BA. Intracellular calcium in signaling human beta-defensin-2 expression in oral epithelial cells[J].{H}Journal of Dental Research,2003.877-882.　　Liu AY,Destoumieux D,Wong AV. Human betadefensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1,bacteria,and the state of differentiation[J].{H}Journal of Investigative Dermatology,2002.275-281.　　Nakashima K,Kokubo T,Shichijo M. A novel Syk kinase-selective inhibitor blocks antigen presentation of immune complexes in dendritic cells[J].{H}EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY,2004.223-228.