重组人β-防御素3对多耐药细菌的抑菌活性分析

　　感染性疾病曾一度威胁人类的生命健康。随着抗菌药物的发现，微生物感染得到了有效控制。但是，由于第三代、第四代头抱菌素、氟咬诺酮类以及碳青霉烯类等抗菌药物在临床广泛应用，革兰阳性菌中的MRSA,VRE，革兰阴性菌中的产ESBLs,AmpC以及MDR,PDR菌株等随之出现并逐渐增多，细菌耐药性已经成为抗感染领域中的严峻问题。　　抗菌肤是存在于真核生物体内，参与免疫应答的小分子多肤，对细菌、真菌、寄生虫及包膜病毒有广泛的抗菌活性，更是被誉为“天然抗生素”,a一防御素3是抗菌肤的一种，因其在结构和功能上的特殊价值，成为新近研究的热点。本文通过比浊法测定rhBD-3对临床呼吸道分离菌株铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性，并分析rhBD-3抑菌活性，测定其MIC值。　　材料与方法　　一、材料:rhBD-3冻干粉购自美国R&D公司(批号4435-BD)，采用基因工程技术在大肠埃希菌中获得，分子量5.2kDa，纯度>95%，一20℃冷冻保存。实验所用菌株均从呼吸科住院病人的下呼吸道分泌物中培养、分离，并且经过Walk-Away96进行菌种鉴定。药敏实验采用OXOID纸片扩散法(K-B法)，药物敏感性标准按美国国家临床实验室标准委员会(2000)判定结果，根据药敏实验结果选择临床多耐药菌株，每种细菌选三株(用A,B,C表示)，排除耐药谱相同的菌株。所有菌株均分装于EP管细菌保存液中，18℃冷冻保存。M-H培养基成分及LB液体培养基成分购自英国OXOID公司。　　二、方法:细菌培养将各种菌种室温解冻后，按照四区法分别接种于MH平板培养基，置于37℃细菌培养箱中，培养24h。每种细菌取三株，分别标为A,B,C组，取单个菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD620值约0.5;rhBD-3原液配置将rhBD-3冻干粉用LB液体培养溶解，使其最终浓度为128岁ml;抑菌实验每株取8管，分别按顺序编号，分别加人LB液体培养基2ml，在各自的第一管中加人含rhBD-3的LB液体2ml，混匀后按照倍比稀释法，浓度分别为64},彭m1,32}a,g/m1,16N,g/m1,8li,g/m1,4N,,g/m1,2N,g/ml,lNg/ml，第8管加人2mlLB液体作为对照;分别吸取每种细菌已配置好的LB菌液0.1ml加人A,B,C组各管中，每个浓度重复3管，所得结果取三管平均值，所有菌液37℃震荡培养16h。紫外光谱分析仪测定OD620值将波长设置为620nm，分别测定菌液的吸光光度值OD620，值越高，细菌浓度越高，计算公式为:细菌数/ml=OD620*5*107/0.2;杀菌浓度测定分别取各管中LB培养液0.1ml，置于MH培养皿中培养24h，观察有无细菌生长。　　三、统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计学分析，资料间的比较用t检验。　　结果　　rhBD-3浓度<2},盯ml时，防御素组OD值与对照组OD值无统计学差异(P>0.05);而rhBD-3浓度在4一16w岁ml时，防御素组oD值与对照组OD值有统计学差异(P=0.0060)，当rhBD-3浓度>16g时，oD值明显下降，如下表。　　rhBD-3的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度:hBD-3浓度为1盯ml时，4种细菌的OD值与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)，分别取各管中LB菌液0.1ml，置于MH培养皿中培养24h,MH培养基上有细菌生长，rhBD-3浓度在2一8Fr岁ml时，细菌生长随rhBD-3浓度增加明显受抑，将无细菌生长的相对应的rhBD-3浓度记为最低抑菌浓度(MIC)，取4种细菌的OD平均值与对照组OD平均值比较，差异有统计学意义(P=0.0030);当rhBD-3浓度>16}.g时，MH培养基中无细菌生长，相对应的:hBD-3浓度记为最低杀菌浓度(MBC)。　　rhBD-3与抗生素MIC平均值比较通过琼脂弥散法分别测定亚胺培南、头抱毗脂、左氧氟沙星、阿米卡星对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的MIC平均值，并与rh-BD-3的MIC平均值比较。亚胺培南、头抱毗肪、阿米卡星与rhBD-3对铜绿假单胞菌的MIC值差异有统计学意义(P<0.05)g4种抗生素与rhBD-.3对鲍曼不动杆菌MIC值差异有统计学意义(P<0.05);头泡毗肠与rhBD-3对铜绿假单胞菌的MIC值差异有统计学意义(P<0.05)。　　讨论　　抗菌肤作为天然免疫分子，是先天免疫系统的重要组成部分，哺乳动物体内存在两类抗菌肤:defensin防御素)和catheliciclin。防御素具有快速识别和清除病原微生物为其特征，是宿主防御素系统第一道防线的重要组成部分。可分为5种类型，即a一防御素，p一防御素，0一防御素，昆虫防御素，植物防御素。p一防御素3是具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肤，相对于其他防御素，a一防御素3是非盐离子敏感性防御素，即在囊性纤维化患者的呼吸道薪膜高盐状态下，也能有良好的抗菌活性，且对院内感染的多耐药菌株也有良好的抗菌活性。Schiblieta研究表明，在低浓度的水溶液中p一防御素3能形成二聚体，即两性二聚体结构，并且汗防御素3表面的正电荷比汗防御素1}a一防御素2明显增多，这些特性使p-防御素3抗菌活性明显强于p一防御素1,p一防御素2}a一防御素3在呼吸系统主要由支气管上皮及肺泡上皮细胞产生，在正常情况下低水平表达，在细菌性肺炎患者的体内，急性感染时相，件一防御素3的表达水平提高，治愈后表达水平降低。　　防御素的活动机制涉及细胞膜的通透性，防御素的确切作用机制尚未明确，不同的抗菌肤作用方式和机制不同，这种相对非特异性的膜渗透机制，使耐药细菌的发生率罕见。目前普遍认可的机制:日一防御素3依靠带正电的两性分子特征，吸附于带负电的微生物表面，破坏磷脂双分子层，并插人其胞膜，形成通道，导致细胞内大分子、盐类外流，最终导致菌体被破坏。但R_防御素3对于骨架系统较为发达的哺乳动物细胞并无损害。　　细菌耐药已成为全球范围内重大公共卫生问题。近年来，抗菌药物的开发速度明显减慢，与此同时，细菌耐药却日趋严重。2005-2010年CHINET中国细菌耐药性监测结果均显示细菌耐药性呈增长性趋势，2010年CHINET监测结果。　　显示临床分离菌株47850株中，46.9%菌株自呼吸道标本中分离，肠杆菌科细菌中最多见者依次为大肠埃希菌、克雷伯菌属。革兰阳性菌中最多见者依次为金葡菌、肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌只包括血液、脑脊液等无菌体液中的分离菌)。监测结果显示，铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率30.8%和25.8%，不动杆菌属中89.6%为鲍曼不动杆菌，该菌除对头饱呱酮一舒巴坦的耐药率为30.7%，对其他所测试药物的耐药率均在50%以上。大肠埃希菌对喳诺酮类药物、庆大霉素、呱拉西林的耐药率均高于50%。近年国内外均出现了碳青霉烯抗生素肠杆菌科细菌和不发酵革兰阴性杆菌增多的报道。此种耐药菌往往多重耐药或泛耐药，其耐药机制极其复杂，所致感染在全球范围内均有发生，并可造成局部暴发流行。国内有研究表明，对革兰阳性菌的最低抑菌浓度为,郭ml，对革兰阴性菌的最低抑菌浓度为8ml，机械通气可能抑制免疫功能正常的大鼠体内p一防御素3的表达水平下调，相应的向这些大鼠支气管内接种细菌，p一防御素3表达下调的大鼠体内则发生呼吸机相关性肺炎，由此可判断汗防御素3具有抑菌作用，且影响表达水平因素较多。此外，a防御素3具有抑制铜绿假单胞菌的生物膜的形成，并对早期和成熟期的生物膜具有破坏作用。本实验选用下呼吸道分离的常见多耐药菌株铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌，实验结果表明:h-83-3对临床多耐药菌株具有显著抗菌作用，低浓度的:hBD-3具有良好的抗菌活性，并且在一定的浓度范围内具有浓度依耐性。rhBD-3对不同细菌的MIC值浓度在4一16}彭ml，与抗生素相比，其MIC值小于部分抗生素MIC值，并且有统计学意义。　　当然，日一防御素3的抗菌活性还需要进一步验证。目前，p一防御素3的生物学功能大部分都是基于体外研究，体内应用途径及治疗价值还需要通过相应动物模型深人探索。　　参考文献　　Arias CA,Murray BE. Antibiotic-resistant bugs in the 21st century-a clinical super-challenge[J].New England Journal of Medicine,2009,(05):439-443.　　Schibli DJ,Hunter H,Aseyev V. The Solution structures of the human β-defensins lead to a better understanding of the potent bactericidal activity of HBD-3 against staphylococcus aureuS[J].Journal of Biological Chemistry,2002.8279-8289.　　Ishimoto H,Mukae H,Date Y. Identification of hBD-3 in respiratory tract and serum:the increase in pneumonia[J].European Respiratory Journal,2006,(02):253-260.　　Reichel M,Heisig A,Heisig P. Skin bacteria after chlorhexidine exposure-is there a difference in response to human beta-Defensin-3[J].Eur J Chin Microbiol Infect Dis,2010,(06):623-632.　　朱德妹,江复,胡付品. 2010年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2011,(05):321-329.　　庹晓晔,柴家科,蒋伟. 重组人β-防御素3对临床分离多耐药菌株的抗菌活性分析[J].中华医院感染学杂志,2008,(11):1528-1530.doi:10.3321/j.issn:1005-4529.2008.11.009.　　Wu Q,Gui P,Yao S. Expression of in lungs of Immunocompetent rats with methicillin-resistant Staphylococcus aureus ventilator-associated pneumonia[J].Journal of Surgical Research,2011,(02):277-283.　　周菁,陈章,田坤. 重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究[J].西南国防医药,2011,(01):4-7.doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2011.01.002.