大蒜素对气道平滑肌细胞α一平滑肌肌动蛋自表达的抑制作用及其机制研究

支气管哮喘(哮喘)是由多种炎性细胞参与的可逆性气道阻塞性疾病，反复发作的哮喘会导致气道出现不可逆性的狭窄，在疾病发展的后期多并发肺气肿、肺源性心脏病，严重影响了患者的生存质量和生命安全，可见控制哮喘的发作和疾病的进展是整个哮喘防治的核心〔1〕。激素是目前临床上控制哮喘的首选药物，而且糖皮质激素可以通过抑制炎症反应阻止哮喘的进展，但目前哮喘发作的控制率不足2%，导致患者的病死率高达36.7/10万，所以，寻找新的药物也是哮喘防治研究一个热点’Z-二我国从古代开始就采用中药治疗疾病，在天然来源的化合物疾病治疗方面也有着悠久的历史，随着化学分离鉴定技术的提高，大量的活性单体成分不断被分离鉴定出来。大蒜素(allicin是从草本植物大蒜中提取的一种活性成分，有研究显示，大蒜素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和消炎等多种生物学功能a-s 本研究中通过观察大蒜素对气道平滑肌细胞(AsMC )。一平滑肌肌动蛋自(a-SMA)表达的影响，研究大蒜素对气道重塑的抑制作用，并探讨其相关的作用机制。

1材料与方法

1.1试剂:青霉素、链霉素、大蒜素购自美国Sigma公司，胎牛血清、DMEM培养基为美国Gibco公司产品，TRIzoI、核酸染料、荧光定量检测聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，a-SM A ,磷酸化Smad 1蛋自(p-Smadl、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD H)抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养:人ASMC购自德国Sinccll公司，在37 0C ,5%COZ条件下DMEM培养液中培养ASMC细胞，培养液含有10%胎牛血清、链霉素100 kU/L和青霉素100 kU/L。

1.3荧光定量PCR检测。-SMA mRN}}4表达:将处于对数生长期的ASMC细胞接种到6孔板(每孔0.5 x 10}个)，待细胞贴壁后分别加人0,2._5,5.0,10.0 N.,mol/工大蒜素处理48 h，去上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加人1 ml TRIzol，按照试剂盒说明书操作，提取ASMC细胞总RNA，反转录出cDNA第一链，检测。-SMA mRNA表达。-SMA基因:上游引物5’一CTGGCATC(;TGCTGGACTC -3',下游引物5’一GCCCATCAGGCAACTCGTA-3'_荧光定量PCR反应条件:94℃15 s,59℃40 x,30个循环。OCt值一目的基因Ct值一内参G APDH基因((: t值，基因的表达量用2-}a值表示。

1.4蛋白质免疫印迹试验( Western blotting)检测a-S1VIA和p-Small蛋白表达:将处于对数生长期的ASMC细胞接种到6孔板(每孔0.5 x 10“个)，细胞贴壁后分别加入0 , 2.5 , 5.0 ,10.0 N,mol/L大蒜素处理48 h，去上清，用PBS洗涤2次，加人lx十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液裂解细胞，95℃10 min ,12000xg离心10 min，取上清，SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE ) , 8%分离胶，12%积层胶，80 V, 2h电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，在含5%脱脂奶粉的洗膜液(TBST)中浸PVDF膜1h封闭非特异性结合，加人1:1000稀释的特异性一抗4℃过夜，加人1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温下1h，化学发光，X线曝光。曝光图片灰度扫描，以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值作为相对表达量。

1.5统计学分析:应用SPSS 12.0统计软件处理数据，计量资料以均数士标准差(X士)表示，采用t检验和方差分析，P} 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大蒜素对ASMC细胞a-SMA mRNA表达的影响(表1):0,2.5,5.0,10.0 N.,mol/L大蒜素处理ASMC细胞后，cx-SMA mRNA表达呈剂量依赖性下调，各剂量间比较差异有统计学意义(均P< 0.05）。

2.2大蒜素对ASMC细胞。-SMA蛋白表达的影响(图1):用。,2.5,5.0,10.0 N..mol/L的大蒜素处理ASMC细胞后，a-SMA蛋白表达呈剂量依赖性下调(0.96士0.02 , 0.72士0.16,0.54士0.11,0.31士0.14)，各剂量间比较差异有统计学意义(均P< 0.05 ) 。

2.3大蒜素对ASMC细胞p-Small 1蛋白表达的影响(图2):用0,2.5,5.0,10.0 Nmol/L的大蒜素处理ASMC细胞后，p-Small 1蛋白表达呈剂量依赖性下调( 0.94士0.03 ,0.76士0.13 ,0.62士0.11,0.43士0.12)，各剂量间比较差异有统计学意义(均P< 0.05 ) 。

3讨论

    哮喘的本质是由嗜酸粒细胞、单核细胞等多种炎性细胞和气道上皮细胞、平滑肌细胞等多种气道固有细胞共同参与的气道慢性炎症过程，一气道高反应性是哮喘的主要临床特’}-s。近期研究显示，气道固有细胞中的平滑肌细胞在哮喘的发病中起着重要作用，在炎症刺激下ASMC细胞可以分泌细胞外基质或者炎症因子，如白细胞介素、转化生长因子(TCF)等都参与哮喘的急性发作和病变的发展cx -SMA是平滑肌细胞的特征性蛋自，作为平滑肌细胞的主要结构蛋自，决定了ASMC细胞的收缩、迁移和生长等重要生命过程，其表达的升高可直接提高ASMC细胞的反应性，加重气道的重塑，因此，靶向a-SM A的治疗也是目前哮喘防治的一个新的研究方向。已有研究显示，大蒜素可以清除过氧化物，阻止氧自由基引起的气道慢性炎症（2〕。本研究显示，大蒜素可以剂量依赖性地下调_4SMC中。-SMA的mfZVA和蛋白表达，说明大蒜素具有降低气道敏感性和抑制气道重构的活性。从而证实了大蒜素可以抑制气道的慢性炎症过程。

平滑肌的增殖、收缩和迁移受到多条信号通路的调节，例如TGF-}和Rho激酶信号通路等，即使在纤维细胞向肌成纤维细胞的转变中也会受到这些信号转导通路的调控，在转化的肌成纤维细胞中。a-SM A也是其主要的结构和收缩蛋白,;复杂的网络调控使机体的生理过程处于一个平衡的状态其中任何一个蛋白的表达失调都会导致机体疾病的发生Small是TGF-日和Rho激酶信号通路的下游靶蛋白，磷酸化后的Small可以人核发挥转录因子的作用，调控下游靶基因的表达，例如-SMA等，所以TGF-日和Rho激酶信号通路的激活可以促进平滑肌细胞的增生和肥大等一系列生理活动。本研究显示，大蒜素可以剂量依赖性地下调ASM细胞中Small 1蛋自的磷酸化水平，说明大蒜素抑制了F-日和Rho激酶信号通路的激活，故而其相应的靶蛋自。-SM4也出现了下调。

    综上所述，本研究显示大蒜素可以下调AS1IC细胞。-SMA的mRNA和蛋白表达，抑制Smad蛋白的磷酸化，阻止TGF-和Rho激酶信号通路是其作用的主要机制。

参考文献

[1] 黄擎绮 . 术前应用双氯芬酸钠镇痛诱发支气管哮喘2例的抢救体会 . 中国危重病急救医学 , 2010年 22卷

[2] 高甜,柴惠,沃兴德 . 大蒜素的药理作用及其开发应用 . 医学研究杂志 , 201 1年 40卷

[3] Bartlett NW,McLean GR,Chang YS . Genetics and epidemiology:asthma and infection . Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology , 2009年 9卷

[4] Bateman ED,Hurd SS,Barnes PJ . Global strategy for asthma management and prevention:GINA executive summary . European Respiratory Journal , 2008年 31卷

[5] 任克吉,张学东,孙健 . 速效型肾上腺糖皮质激素在支气管哮喘中的应用 . 中国危重病急救医学 , 2009年 21卷

[6] Bentley JK,Hershenson MB Airway smooth muscle growth in asthma:proliferation,hypertrophy,and migration . PROCEEDINGS OF THE AMERICAN THORACIC SOCIETY(PATS) , 2008年 5卷

[7] Meyer-ter-Vehn T,Han H,Grehn F . Extracellular matrix elasticity modulates TGF-β-induced p38 activation and myofibroblast transdifferentiation in human tenon fibroblasts . Investigative Ophthalmology & Visual Science , 2011年 52卷

[8] McMurtry IF,Abe K,Ota H . Rho kinase-mediated vasoconstriction in pulmonary hypertension . Advances in Experimental Medicine and Biology , 2010年 661卷

[9] Koziol-White CJ,Panettieri RA Jr . Airway smooth muscle and immunomodulation in acute exacerbations of airway disease . Immunological Reviews , 2011年 242卷

[10] Meng L,He X,Zhu W . TLR3 and TLR7 modulate IgE production in antigen induced pulmonary inflammation via influencing IL-4 expression in immune organs . PLoS One , 2011年 6卷