脯氨酸羟化酶在缺血缺氧性疾病治疗中的研究进展

氧气是需氧生物赖以生存的物质,长期进化过程中,生物体形成了从环境中获取氧的能力,以此为基础形成有氧代谢这种更有效的产能途径,从而满足机体的需求。缺血缺氧性疾病是影响人类健康的一类以氧气需求与供给失衡为特征的疾病,如心肌缺血、中风、肺动脉高压、贫血以及几乎所有类型的癌症。近年来发现一种新的细胞氧感受器脯氨酸羟化酶(,PHDs)/天冬酰胺酰羟化酶(又被称为低氧诱导因子抑制因子(FIH1),它们参与调节氧供与氧耗、能量代偿与能源补充、氧顺应性和缺氧耐受力及其他生理或病理过程中的代谢保护机制,在缺血预处理和改善缺血缺氧疾病预后中发挥重要作用。本文就PHDs在缺血缺氧性疾病治疗中的应用前景和存在问题予以概括。

1 PHDs是细胞氧感受器参与低氧应答反应

机体内的细胞并非处于同一氧水平,不同解剖部位或生理病理情况下氧分压差别很大。昆虫依赖气道传输系统,哺乳动物依靠血管,氧能够运送到深部组织的细胞中。然而,与这些管道相距较远的细胞则处在低氧分压中。与此同时,细胞面临着另一个挑战为氧浓度是不恒定的且时时发生波动。鉴于氧重要的生物学作用,是否能感知氧浓度的细微变化对细胞非常关键。

进化过程中多种感受氧的机制逐步形成,迄今为止,细胞氧感受器包括NADPH氧化还原酶、线粒体电子传递链成分、血红素蛋白、氧敏感的K+通道和一个Fe2+、2酮戊二酸依赖的双加氧酶家族——PHDs类及FIH1。

低氧诱导因子(HIF-1、2、3)是细胞低氧应答反应中的关键转录因子。低氧情况下,HIFα亚基蛋白水平表达急剧增加,随后发生核转位,与广泛表达的结构亚基HIFβ形成二聚体,加强下游靶基因的转录活性[1]。这个过程涉及的基因参与适应低氧代谢,包括能量补充、氧顺应性、低氧耐受性、氧化还原与酸碱平衡、氧供以及其他许多过程[2]。已有大量基因被确定为HIFs的靶基因,并在细胞适应缺氧的过程中发挥作用[3]。HIFα亚基不能直接感受氧,这一过程需要PHDs和FIH。PHDs和FIH为Fe2+、2一酮戊二酸依赖的双加氧酶,它们利用O2的一个氧原子分别使HIFα亚基脯氨酸残基和天冬酰胺残基羟化[4]。另一个氧原子使2酮戊二酸转化为CO2和琥珀酸。PHDs能使HIFα亚基氧依赖性降解区(ODDD)中特定的脯氨酸残基羟化。常氧情况下,脯氨酸残基羟化后,HIFα亚基更易被肿瘤抑制蛋白识别,然后连接到E3泛素连接酶复合体上,最后经泛素化途径降解。FIH使HIFα亚基羧基端的天冬酰胺残基羟化,削弱与转录辅因子p300结合,从而抑制HIFs的转录活性[5]。低氧情况下,PHDs和FIH失去活性,HIFα亚基稳定表达,转录活性升高。尽管PHDs/∏H同氧的亲和力非常低,PHDs的KM值为10O~250uM,ΠH的KM值为90uML6J,但比组织氧分压的水平要高的多[7],生理水平氧分压波动的情况下,PHDs/∏H有足够的应对能力。此外它们的活性并不只取决于氧分压水平,还与2酮戊二酸(辅酶)、Fe2+(辅因子)、线粒体活性氧和抗坏血酸有关[4]。已发现三种PHD亚型,PHD1、PHD2、PHD3。这三种亚型都能羟化HIFα的LXXLAP序列并且均具有一个高度保守的结构域,允许2酮戊二酸和Fe2+结合。但是这三种PHDs组织表达、亚细胞定位、底物特异性、活性以及调控方面略有不同。PHD1主要在核内表达,PHD2集中在细胞质中(但是能在细胞核与细胞质之间穿梭)[:彐,PHD3在细胞核与细胞质中都有表达。Huang等研究发现它们的活性是PHD2)PHD3)PHD1[9],但Tuckerman等发现PHD2和PHD3的活性接近但略高于PHD1[10]。抑制细胞氧感受器PHDs/FIH,在常氧下能诱导低氧适应性反应,稳定HIFs表达,进而激活一系列下游靶基因,促进红细胞生成、血管形成、糖代谢等最终达到保护缺氧组织的作用。

2干预PHDs能从多方面缓解组织缺血缺氧状况

2.1抑制PHDs可增加缺血组织血液与氧气供给

2.1.1促进血管新生HIFs在生理和病理情况下在血管生成过程中起关键作用。通过多种血管和动脉性因素的基因程序转换,HIFs能够诱导形成一个成熟、稳定且有功能的新生血管体系。临床前研究表明基因导人HIF1α会促进血管再生以及改善缺血组织的功能恢复。PHDs作为HIFs上游调节因子,也参与到血管再生的过程中。条件性敲除PHD2诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达增多以及活跃的血管生成。与此结果一致,模拟实验中,使用TM6008(一种化合物可抑制人类PHD2基因)作用小鼠,结果血管新生增加[12]。小鼠出生后敲除PHD2会增加心、肺、肾、肝中血管的数目和管径大小,然而这些小鼠过早的死于循环充血和扩张性心肌病,预示着心血管系统需要PHD2的密切调控,因此使用PHD抑制剂治疗需谨慎。PHD3也参与了血管生成:小鼠后肢缺血,血运重建术后,沉默PHD3的治疗效果优于沉默PHD2。然而缺失PHD1,目前为止未发现血管改建的现象。

2.1.2促进红细胞生成红细胞生成素促进红细胞生成。胚胎发育时期肝是EPO产生的主要器官。出生后,这一功能逐渐被肾脏代替。在慢性肾病人群中,10%~20%的患者并发贫血。使用药物重组EPO治疗,花费昂贵且需肠外给药,有心血管副作用和增加病死率的危险。HIF调控EPO的转录。PHD2是主要的HIF脯氨酸羟化酶,在胚胎发育中起重要作用。缺失PHD2的成年小鼠有严重的红细胞增多症,血清中EPO急剧增加同时肾中EPO mRNA增多。单纯敲除PHD1或PHD3对红细胞生成无影响[I4],但是联合敲除PHD1和PHD3会导致肝内HIF2α积累及适度的红细胞生成增多。这些结果表明PHD1/3均缺失导致红细胞生成增多,是由于在某种程度上激活了肝内HIF2α/EPO通路,而PHD2缺失导致的红细胞生成增多,是通过激活肾内途径引起的。这些发现连同早期的研究工作,预示着PHD2失活足以最大限度的促进肾脏EPo生成,而这三种PHDs亚型均失活则重新激活肝分泌EPO。因此,治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血所选的药物必须抑制三种PHDs亚型,而治疗肾病患者只需抑制PHD2即可[15]。

2.2 PHDs参与代谢转换以适应缺氧PHDs/FIH作为细胞氧感受器是新陈代谢的保卫者。当组织氧分压下降超过生理范围时,它们会启动防御机制,防止能量缺乏和ATP耗竭,确保细胞在低氧坏境中不会受到致命性损伤。“巴斯德效应”是一种细胞适应缺氧的机制即有氧代谢向无氧代谢转换。有了这种能量补偿机制,尽管缺氧,细胞仍能继续生成ATP满足代谢的需求。氧感受器同HIFs协同调节该种代谢适应。低氧环境中,HIF1α通过上调糖酵解过程中的关键基因来增加糖酵解通量,如葡萄糖转运子GLUT1和GI'UT2,己糖激酶HK1和HK2以及乳酸脱氢酶[16]。PHDs也通过感受糖酵解水平及三羧酸循环(TCA)的代谢产物,促进向厌氧机制转换。例如,糖酵解的中间产物丙酮酸和乳酸,TCA中间产物草酰乙酸和苹果酸,抑制PHDs/FIH,原囚可能是它们作为2酮戊二酸的竞争物或通过解耦联反应使其失去活性;结果为HIFs稳定性增加和糖酵解通量提高[17]。小鼠基因遗传学证实PHD1缺失的情况下,缺血肌纤维中的糖酵解通量增强。

2.3 PHDs对氧顺应性的调控氧顺应性是指细胞在缺氧的情况下,降低氧耗量,减少能源消耗的能力。这种适应可以提高动物在低氧环境中的生存能力,并可诱导缺氧耐受机制[18]。许多物种,例如穴居或潜水动物、冬眠动物和休眠的线虫幼体等能在低氧环境中生存,就归功于氧顺应性。人类也表现氧顺应性的迹象,如生活在高海拔地区的人群以及宫内胎儿对低氧环境的适应。这种节能机制依赖多种途径达成。调节氧耗的关键因子是HIF1α,它能抑制丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的活性,上调丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)和PDK4。PDK1和PDK4均能限制糖酵解中间产物丙酮酸进入TCA[19],从而降低氧化代谢水平减少氧耗。此时ATP生成更依赖无氧糖酵解。此外,HIR1α下调线粒体呼吸酶琥珀酸脱氢酶划,诱导细胞色素C亚型之间的转换[21],在低氧环境中降低呼吸水平优化呼吸效率。此外,为了在缺氧条件下节约能量,细胞减少不必要的合成代谢或能量消耗过程例如蛋白质的合成、折叠和降解,离子泵的活动或其他耗能过程。研究表明细胞氧感受器是氧顺应性的主要调节因素。体外和体内实验研究均证明,药物干预PHDs/FIH或沉默PHD1的心肌细胞和骨骼肌细胞氧耗量降低[9]。缺失PHD1引起PDK1和PDK4表达增多,从而减少葡萄糖氧化降低氧耗。其中PDK1是HIF1α介导的,PDK4则依赖PPARα调控[19]。特异性敲除PHD1引起肌细胞缺氧耐受,不伴有血管生成和红细胞增多,在一定程度上是通过激活HIF2α实现的。抑制PHD1促进多种保护机制启动,例如加强糖酵解产生ATP,下调PDC限制氧化磷酸化的底物量,最终进人线粒体电子传递链的电子减少。最终达到节约能量,减少氧化损伤,保护低氧环境中的细胞。HIF2α是低代谢适应中PHD1的下游靶基因,缺失HIF2α则氧顺应性这种保护机制受损,而缺失HIF1α的影响甚微[19]。遗憾的是,目前没有特异性抑制剂专门针对不同的PHDs亚型。

2.4抑制PHDs可对抗缺血再灌注损伤(ischemia reperfusi°n呐ury,IRI)IRI是指细胞因缺血发生可逆性、可存活的损伤,在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍。氧化应激是IRI事件发生的主要原因之一,活性氧(reactive。/xygen species,ROS)是线粒体呼吸的副产物,缺氧情况下,ROS产生增多。如缺血细胞继续消耗氧气,ROS积累达到有毒水平,会对线粒体呼吸酶造成不可逆的损害。ROS还可通过对脂质和核酸的破坏性分子链反应促进再灌注损伤的发生发展。因此,消除有毒的ROS或防止其形成是治疗缺血缺氧性疾病和对抗IRI的策略。敲除PHD1的缺血肌纤维,线粒体呼吸和氧耗下降,ROS生成减少,线粒体和其他细胞器面临较少的氧化损伤,从而能继续产生ATP维持生存[19]。schneider等L22]的研究印证了上述机制,缺失或瞬时沉默PHD1诱导肝细胞缺氧耐受,重调代谢减少氧耗减少ROS生成,从而保护缺血肝细胞对抗缺血再灌注损伤。心肌是发生IRI的最常见组织之一。近年来,越来越多的学者关注于PHD小分子抑剂剂,推测其可用于临床,保护缺血心肌防止发生再灌注损伤。最近,Bao等研究发现一种新型的口服PHD抑制剂GSK360A可以促进局部和全身HIF1α信号通路保护梗死后的心[23]。PHDHIF1α介导的心脏保护作用为心血管疾病和缺血缺氧性疾病提供了新的治疗靶点。急性再灌注期间心肌中产生过多的ROS,HI,1α稳定性降低,细胞的基本生命活动如糖酵解、红细胞生成和细胞凋亡受损。抑制PHD1、HIF1α累积,其稳定性和转录活性增加,激活血管形成和红细胞生成,保护心肌对抗凋亡。Adluri等[25]报道,抑制PHD1可上调HIF1α以及其下游基因阡catenin、eNOS、NRκB和Bc12,减少细胞凋亡和心肌梗死面积对抗缺皿再灌注损伤。

2.5 PHDs在缺血预处理中的作用1986年Murry首次发现实验犬心肌在经历了短暂缺血后对随后持续严重的缺血有保护作用,并将这种使心脏耐受力增加的现象称为缺血预处理(IP)。IP是由于心肌对缺血的内在抵抗力增加,这是心肌具各的内源性自我保护调控能力[26]。IP的保护作用不仅存在于心脏,而且存在于心脏以外的其他组织器官。例如,短暂性脑缺血发作,可降低中风的严重性。IP不像氧顺应性依赖代谢抑制。多种机制参与其中,涉及内源性保护物质的产生与释放、细胞膜上相关受体开放和细胞内信号通路。这里讨论IP过程中,由PHD⒌HIFs介导的分子机制,可能的治疗意义以及PHD⒌HIF作为潜在的IP治疗药物所需注意事项。研究发现部分或完全沉默HIF1α,缺血心肌的预处理保护作用丧失,相反沉默PHD2改善心肌预处理功能E27]。腺苷是一种内源性心肌保护物质,可扩张冠脉,保护心肌与血管内皮细胞、增加葡萄糖摄取和改善能量代谢,在早期缺血预处理中发挥重要作用。蛋白激酶C(PKC)在IP细胞内信息传递过程中起重要作用,PKC激活可限制心肌梗死面积。上调基因编码核苷酸酶,已知⒌核苷酸酶可以作用于AMP使之生成腺苷,又是PKC的磷酸化底物。故沉默HIF=1α扭转了缺血预处理对心肌的保护作用,沉默PHD2则促进保护作用。

类似的分子保护机制在肝肾IP中也能发现[29J。PHDs~HIFs在神经系统IP过程中也发挥作用,例如上调神经保护因子表达,如VE0F和EPO,抑制PHDs会减少脑缺血引起的功能损害。3月甫薹四盒尧圣化图臣抑(proⅡne hydroxyIase孟nhibitor,PHI)细胞氧感受器在缺血缺氧性疾病的发生发展过程中发挥重要作用,PHDs作为一系列疾病的治疗靶点得到了越来越多的关注。PHI通过调控PHD对HIF的羟基化作用,抑制HIF蛋白降解,维持HI的生物学作用。PHI大致分为两类,一类为铁螯合剂或铁竞争剂包括去铁敏、环吡酮胺和氯化钴,它们可以结合HIF ODDD的Fc2+结合位点,从而阻止HIF ODDD与PHD结合,终止羟化反应,最终使HIF一免于降解;另一类为酮戊二酸类似物包括DMOG、FG4487、FG4497等,它们通过与内源性的2酮戊二酸竞争从而抑制PHD。现有的PHI缺乏特异性,不能选择性抑制特定的PHD亚基,限制了临床应用价值。以芳香杂环化合物为基础的嘧啶衍生物,如8羟基喹啉目前正在开发阶段,可抑制PHD,选择性修改HIF介导的基因表达.

目前的工作为研究开发小分子PHI,并且需要更多的研究来评估其功能、生物学作用和安全性。4展望缺血缺氧性疾病严重影响人类健康,抑制细胞氧感受器PHDs为治疗该种疾病提供了一个新的治疗靶点。然而,PHI真正运用于临床治疗,还有许多工作亟待研究。不同PHD亚型在不同组织中的表达和功能了解还有限。目前特异性的PHI还处于研究阶段,临床效果如何还需更多的实验加以验证。

使用PHI治疗缺血缺氧组织过程中,是否会对健康组织产生影响?目前研究发现在基础条件下小鼠敲除PHD1,各系统器官功能无障碍;有孕小鼠敲除PHD2,会引起胎盘功能障碍[31];小鼠缺失PHD3,则导致低血压[32]。使用PHI治疗肾病导致的贫血,有引发红细胞增多症的风险。因此,需要对PHI进行长期监管来提高其治疗安全性。未来的工作重点是研究出选择性PHI,特异性的针对不同PHD亚型和不同的组织器官。

参考文献：

[1]Semenza GL.Life with oxygen[J].Science,2007.62-64.

[2]Simon MC,Keith B.The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2008.285-296.

[3]Semenza GL.Targeting HIF 1 for cancer therapy[J].Nature Reviews Cancer,2003.721-732.

[4]Kaelin WG Jr,Ratcliffe PJ.Oxygen sensing by metazoans:the central role of the HIF hydroxylase pathway[J].Molecules and Cells,2008.393-402.

[5]Lando D,Gorman J J,Whitelaw ML.Oxygen dependent regulation of hypoxia-inducible factors by prolyl and asparaginyl hydroxylation[J].European Journal of Biochemistry,2003.781-790.

[6]Ehrismann D,Flashman E,Genn DN.Studies on the activity of the hypoxia inducible-factor hydroxylases using an oxygen consumption assay[J].Biochemical Journal,2007.227-234.

[7]Gnaiger E,Lassnig B,Kuznetsov A.Mitochondrial oxygen affinity,respiratory flux control and excess capacity of cytochrome c oxidase[J].Journal of Experimental Biology,1998,(Pt 8):1129-1139.

[8]Steinhoff A,Pientka FK,M(o)ckel S.Cellular oxygen sensing:Importins and exportins are mediators of intracellular localisation of prolyl 4-hydroxylases PHD1 and PHD2[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2009.705-711.

[9]Huang J,Zhao Q,Mooney SM.Sequence determinants in hypoxia-inducible factor lalpha for hydroxylation by the prolyl hydroxylases PHD1,PHD2,and PHD3[J].Journal of Biological Chemistry,2002.39792-39800.

[10]Tuckerman JR,Zhao Y,Hewitson KS.Determination and comparison of specific activity of the HIF-prolyl hydroxylases[J].FEBS Letters,2004.145-150.