辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制

　　作者：杨捷,冯玉麟,耿艳鸣,乔云飞　　作者单位：扬州大学医学院附属苏北医院呼吸内科，江苏 扬州

　　【摘要】 目的 观察具有抗炎活性的辛伐他汀对脂多糖 (LPS) 诱导的肺泡上皮细胞A549黏蛋白表达的影响并探讨其机制。方法 用不同浓度的辛伐他汀作用于培养的A549细胞，采用定量RTPCR、ELISA和明胶酶谱法分别检测细胞的黏蛋白MUC5AC mRNA表达水平、MUC5AC蛋白含量及细胞上清基质金属蛋白酶 (MMP)9活性。结果 辛伐他汀组细胞中MUC5AC蛋白含量及MUC5AC mRNA水平较脂多糖组均明显下降(P<0.05)， 且浓度越高，作用越强。在正常情况下A549细胞培养上清液中几乎检测不到MMP9活性，而LPS作用后上清中MMP9活性明显增强(P<0.01)，预先给予不同浓度辛伐他汀孵育细胞培养上清液MMP9活性显著下降(P<0.05)。结论 LPS诱导的A549细胞黏蛋白MUC5AC在mRNA和蛋白水平的升高与MMP9活性增强有关,而辛伐他汀可减少LPS诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达，且呈浓度依赖性,提示其作用可能与抑制MMP9活性有关。

　　【关键词】 辛伐他汀;脂多糖;黏蛋白;肺泡上皮细胞

　　黏液高分泌是包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等在内的慢性气道炎症性疾病重要病理生理特征。过度分泌的黏液因其可加重气流阻塞并作为细菌定植和生长的培养基，导致抗生素效能下降，而成为影响疾病死亡率的一项独立危险因素〔1〕。细菌感染可促进黏液高分泌，即临床所说的痰液增多，甚至痰栓形成，其中革兰阴性杆菌的重要毒力因子脂多糖(LPS)是强效促黏液分泌剂。在本研究中，体外黏液高分泌模型的建立是通过LPS刺激具有表达黏蛋白能力的肺泡上皮细胞A549。气道黏液的黏弹性主要取决于由黏膜下腺体的黏液腺细胞和气道上皮的杯状细胞合成的高度糖苷化蛋白质的黏蛋白(MUC)。现已证实MUC5AC是慢性炎症时呼吸道黏液所呈现的主要MUC表型〔2〕。研究表明，他汀类降脂药具有抗炎作用，并对病毒性肝炎、肾炎等疾病具有治疗作用。本研究通过LPS诱导A549细胞建立体外黏液分泌模型，旨在初步探索辛伐他汀对气道黏液分泌的影响及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 肺泡上皮细胞株A549由本实验室保存。辛伐他汀购自杭州默沙东制药公司;LPS、明胶、噻唑蓝 (MTT)、Tripure购自美国Sigma公司;胰蛋白、RPMI1640购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;小鼠MUC5AC单克隆抗体购自Chemicon公司;基质金属蛋白酶明胶酶谱法电泳分析试剂盒为上海GeneMed Scientifics公司产品;TaqDNA聚合酶为美国Promega公司产品;PCR试剂盒为大连宝生物工程公司产品;cDNA第一条链合成试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。

　　1.2 细胞培养 A549细胞常规培养于含10%灭活的胎牛血清，并加入1%L谷氨酰胺及1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中，放置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育;当细胞融合达70%～90%时，换用无血清培养基继续培养24 h。

　　1.3 药物处理〔3〕 辛伐他汀按16 mg/ml溶于0.06 mol/L NaOH和40%乙醇，于50℃加热2 h，用HCl调整溶液pH至7.2，加入等体积的蒸馏水，使其浓度为40 μmol/L，冻存于-20℃备用。采用MTT比色法检测实验浓度辛伐他汀对细胞活力影响，酶联免疫检测仪于570 nm波长测定各孔吸光度值(A)。计算细胞活力：细胞存活率=实验组A值/阴性对照组A值×100%，每实验组设8个复孔，取均值。

　　1.4 分组 细胞随机分为对照组 (无血清培养基培养)、LPS组(无血清培养基中加入10 μg/ml LPS)、辛伐他汀组 (无血清培养基中加入30 μmol/L辛伐他汀)、LPS+20 μmol/L辛伐他汀组 (先于无血清培养基中加入20 μmol/L辛伐他汀孵育30 min后，再给予同样浓度LPS)、LPS+30 μmol/L辛伐他汀组 (先于无血清培养基中加入30 μmol/L辛伐他汀孵育30 min后，再给予同浓度LPS)，各组均培养24 h后行指标检测。

　　1.5 荧光定量RTPCR检测细胞MUC5AC mRNA表达 提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA，再行定量PCR。引物由上海Genebase生物公司合成。MUC5AC上游引物序列为5′TCCTTCTTGTCAATGGTGTCT3′;下游为5′ACCAGGTTCAGGACAAGTAG3′;GAPDH上游引物序列为5′CCTCAAGATTGTCAGCAAT3′;下游为5′CCATCCACAGTCTTCTGAGT3′。根据目的基因MUC5AC与管家基因GAPDH的标准曲线，将提取的RNA样品进行定量，PCR反应条件是预变性：94℃×2 min;再94℃ 25 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s共40个循环;最后72 ℃延伸5 min。将检测荧光强度的时相设定在扩增反应的退火期 (50 ℃ 30 s)，读取样品扩增达到所设阈值的反应循环数Ct值，△△Ct=Ct(目的基因待测样品GADPH待测样品)Ct(校正样品GADPH校正样品)，计算得到MUC5AC相对于GAPDH的定量。

　　1.6 ELISA法检测细胞裂解上清液中MUC5AC蛋白含量 提取细胞内蛋白，行总蛋白定量，取各组样本测定总蛋白量后用裂解液调整蛋白浓度使各样本一致，并用0.01% PBS稀释蛋白样本。采用ELISA方法测定MUC5AC蛋白含量。

　　1.7 明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶9(MMP9)活性 收集各组细胞上清液，于4℃，2 000 r/min，离心5 min去细胞碎片，将上清置于70℃冻存备用。吸取10 μl条件培养液于1.5 ml EP管，加入上样液，混匀，室温下静置10 min;取20 μl样品于含明胶的10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1～2 h，置已完成的凝胶于10 ml 2.5% TritonX100溶液中浸泡低速振摇1 h，于明胶酶缓冲液中37℃孵育18～24 h，用0.5%考马斯亮蓝染色，加入10%乙酸、40%甲醇混匀，脱色至白色条带与蓝色背景对比清晰即可。凝胶扫描、照相、使用Scion Image 4.0.2β图像分析软件测定白色条带的光密度值(OD)，计算各组MMP9相对活性。

　　1.8 统计学处理 数据均以x±s表示，使用统计分析软件SPSS 10.0进行数据分析，两两比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 辛伐他汀对A549细胞MUC5AC mRNA表达的影响 两种实验浓度的辛伐他汀对细胞活力影响小，电镜下观察细胞无明显改变，细胞贴壁能力好。无LPS刺激时A549细胞即有MUC5AC mRNA的表达，而LPS刺激后细胞中MUC5AC mRNA的表达明显增加(P<0.01);在20和30 μmol/L两种浓度辛伐他汀干预下，可使MUC5AC mRNA的表达明显降低(P<0.05)，且两组MUC5AC mRNA表达也存在显著性差异(P<0.05)，见表1。

　　2.2 辛伐他汀对A549细胞MUC5AC蛋白表达的影响 LPS刺激后，细胞MUC5AC蛋白相对含量 (以MUC5AC/总蛋白表示) 较对照组明显升高(P<0.01);预先给予两种浓度辛伐他汀处理后再予LPS刺激，MUC5AC蛋白水平显著下降(P<0.05)，不同浓度辛伐他汀干预作用有差异(P<0.05)，见表1。

　　2.3 辛伐他汀对A549细胞MMP9活性的影响 凝胶中的明胶能被MMP9分解，因此在考马斯亮蓝染色后，在蓝色背景下于92 kD分子量处出现白色负染色条带。正常情况下A549细胞在没有外界刺激下几乎不表达MMP9活性。LPS刺激后细胞上清液中MMP9活性明显增加(P<0.01);预先给予两种浓度辛伐他汀处理后再予LPS刺激，MMP9活性明显降低(P<0.05)，不同浓度辛伐他汀干预作用有差异(P<0.05)，见表1。1 LPS和辛伐他汀对A549细胞MUC5AC表达及MMP9活性的影响与对照组比较：1)P>0.05，2)P<0.01;与LPS组比较：3)P<0.05;与LPS+30 μmol/L辛伐他汀组比较：4)P<0.05

　　3 讨 论

　　黏蛋白决定黏液的理化性质，多种内外因素能通过多种机制诱导其合成和分泌增加，导致黏液高分泌，其中LPS是强有力促分泌因子〔4〕，本研究也显示LPS刺激后A549细胞黏蛋白MUC5A mRNA和蛋白水平均明显升高，体外黏液高分泌模型建立成功。

　　他汀类药物临床上主要用于各种原因引起的高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病防治。而他汀类药物除了降脂作用外，还具有抗炎作用。MMP9是炎症时最主要的基质金属蛋白酶，也是呼吸系统疾病中主要的MMP，其活性增强，可以降解细胞外基质，而慢性气道炎症性疾病最重要的病理特征是气道结构重建，主要表现为黏液腺上皮化生和细胞外基质的改变〔5〕。在临床上，细菌感染是慢性气道炎症性疾病患者急性加重的最常见诱因，其中革兰氏阴性菌因其所致的感染常导致患者痰液增多，黏稠及抗生素高耐药性，而成为人们关注及研究的对象，LPS是重要毒力因子，它可使细胞MMP9活性增强〔6〕。本研究中，A549细胞在没有任何处理下几乎不表现出MMP9活性;予LPS刺激后，细胞培养上清液中MMP9活性显著增加。MMP9活性增加导致细胞外基质的破坏，从而参与气道结构重建，引发了慢性炎症疾病局部气道包括黏液高分泌在内的后续一系列病理生理改变，从某种意义上说MMP9启动了气道炎症级联反应。大量心血管疾病方面研究证实MMP9在动脉粥样硬化的发病机制中担当重要角色，而他汀类药物可通过抑制MMP9活性来发挥其在动脉粥样硬化治疗中的非降脂作用〔7〕。本研究提示辛伐他汀可下调MUC5AC表达，其机制可能与抑制MMP9活性有关。多种刺激因子可通过不同的信号传导途径激活MMP9，而LPS可能是通过激活丝裂原活化蛋白激酶Ras/p38MAPK信号通路来影响MMP9活化，辛伐他汀作为胆固醇代谢限速酶抑制剂可调节胆固醇合成过程中间代谢产物，后者参与了重要信号蛋白Ras的合成，从而影响MMP9活性。

　　综上，辛伐他汀可在转录水平和蛋白水平上减少LPS诱导的A549细胞黏蛋白MUC5AC蛋白过度表达，此作用可能通过调控MMP9活性实现，正因为后者活性下降，对细胞外基质破坏减少，使气道炎症反应局限在适当范围，从而影响了由多种炎症机制参与的黏液高分泌。因此辛伐他汀的抗炎能力可能在抑制慢性炎症性疾病气道黏液高分泌方面发挥积极作用，同时鉴于他汀类药物作用的多效性，其分子水平的具体机制还有待更深入的研究。

　　【参考文献】

　　1 Shale DJ，Inonescu AA.Mucus hypersecretion：a common symptom，a common mechanism〔J〕? Eur Respir J，2004;23(6)：7978.

　　2 Rose MC，Voynow JA.Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease〔J〕.Physiological Rev，2006;86(1)：24578.

　　3 Mc Kay A，Leung BP，Mc Innes IB,et al.A novel antiinflammatory role of simvastatin in a murine model of allergic asthma〔J〕.Immunol，2004;172(5)：29038.

　　4 Smirnova MG，Guo L，Birchall JP,et al.LPS upregulates mucin and cytokine mRNA expression and stimulates mucin and cytokine secretion in goblet cells〔J〕.Cell Immunol，2003;221(1)：429.

　　5 Jeffery PK.Remodeling and inflammation of bronchi in asthma and chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Proc ATS，2004;1(3)：17683.

　　6 Ohbayashi H.Matrix metalloproteinases in lung diseases〔J〕.Curr Protein Peptci，2002;3(4)：40921.

　　7 Hwang J，Hodis HN，Hsiai TK,et al.Role of annexin II in estrogeninduced macrophage matrix metalloproteinase9 activity：the modulating effect of statins〔J〕.Atherosclerosis，2006;189(1)：7682.