非小细胞肺癌组织中ET1、TSP1的表达与血管生成的相

　　作者：王春玲,阎红娥,刘甡,李爽　　作者单位：佳木斯大学第一附属医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯

　　【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中内皮素 1(ET1)、血小板反应蛋白 1( TSP1)的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法 用免疫组化法检测45 例NSCLC 组织和18 例正常肺组织中ET1、TSP1的表达及微血管密度(MVD)的计数。结果 NSCLC 组织中ET1的阳性表达率(42.22%)显著高于对照组，ET1的表达与NSCLC的组织学分级、淋巴结转移有密切关系，ET1阳性组MVD明显高于ET1阴性组。TSP1在NSCLC中的阳性表达率(37.78%)低于对照组，TSP1的表达与淋巴结转移有关，TSP1阳性组MVD低于TSP1阴性组。MVD与ET1表达水平呈正相关，与TSP1表达水平呈负相关。结论 在NSCLC 组织中ET1作为一种促血管生成因子，TSP1作为一种抑制血管生成因子，两者参与肺癌的血管形成，且有协同作用。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;内皮素1;血小板反应蛋白1;血管形成

　　内皮素1(ET1)作为促血管生成因子之一〔1〕，而血小板反应蛋白1 (TSP1) 作为血管生成抑制因子之一〔2〕，两者在肿瘤血管形成中的作用日益引起广泛的重视。本实验采用免疫组化法检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织中ET1、TSP1的表达及其与微血管密度(MVD)的关系，并探讨它们在NSCLC中与血管生成、肿瘤侵袭转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织标本

　　收集我院2006～2009年手术切除并经病理确诊的NSCLC病例45例，年龄32～75〔平均(61.2±13.9)〕岁,其中，男27例，女18例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗，其中，鳞癌31例，腺癌14例;高分化19例，中分化12例，低分化14例;有肺门或纵隔淋巴结转移的16例，无淋巴结转移的29例。同时选取18例同期手术的正常肺组织作对照。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人TSP1单克隆抗体购于美国Neomarker公司;兔抗人内皮素多克隆抗体、兔抗人第8因子相关抗原多克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠、羊抗兔免疫球蛋白(IgG)及链霉菌抗生物素过氧化酶(SP)试剂盒,均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3 实验方法

　　所有石蜡标本均行5 μm连续切片，一张切片行苏木素伊红(HE)染色核实病理诊断，其余切片按SP试剂盒提供的说明书操作，采用SP免疫组化法，检测组织中ET1、TSP1和凝血因子(FⅧRAg)蛋白的表达，二氨基联苯胺(DAB)显色,免疫组化后再经HE复染。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，用武汉博士德生物工程有限公司提供的已知阳性切片作阳性对照。

　　1.4 结果判定

　　1.4.1 ET 1、TSP1的阳性表达

　　肿瘤细胞胞浆及细胞外基质呈现棕黄色染色,明显高于背景(或背景不着色而细胞着色)者为阳性细胞。测定采用双盲法,2人阅片。先在100倍视野下筛选ET 1、TSP1表达最强区,每张切片选3 个视野，然后在200倍视野下,按显色强度(未着色、弱、中、强)和阳性细胞百分数(0;1%～25%;26%～50%;>50%者)分别积分为0,1,2,3分。两项数值之和为0～2分者为ET1、TSP1表达阴性，3～6分者为ET1、TSP1表达阳性。

　　1.4.2 MVD的测定

　　参考Weidner方法，先在低倍镜(40倍)下扫视整个切片，确定对FⅧRAg明显着色(棕褐色)MVD最高区，即所谓热点区。然后换成高倍镜(200倍)进行记数，结果以3个视野血管的均数表示。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS12.0软件系统进行统计分析，计量资料以x±s表示，所得数据采用t检验和方差分析，计数资料采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 NSCLC中ET1的表达及与NSCLC临床特征的关系

　　18例正常肺组织中，ET1表达均为阴性,无阳性表达。ET1着色主要分布于肿瘤细胞胞浆中，表现为黄色或棕褐色颗粒，阳性肿瘤组织及其邻近基质组织中血管内皮细胞和成纤维细胞也有不同程度的着色。NSCLC中ET1阳性率为42.22%(19/45)，显著高于正常对照组(P<0.05);且ET1的表达与NSCLC的组织学分级、淋巴结转移有密切关系(P<0.05)，而与病理分型无明显关系(P>0.05)，见表1。

　　2.2 NSCLC中TSP1的表达

　　在NSCLC中TSP1的阳性表达率为37.78%(17/45)，明显低于正常肺组织的表达率86.67%(39/45)，TSP1 阳性产物主要分布于癌细胞的胞质内,呈棕黄色颗粒,肺癌间质及巨噬细胞胞浆内也有TSP1 的阳性表达。在16例有淋巴结转移组中TSP1 阳性率明显低于无淋巴结转移组(P<0.05)，TSP1的表达与不同组织类型、分化程度无相关性(P>0.05)。表1 ET1与临床病理参数之间的关系(略)

　　2.3 ET1、TSP1的表达与MVD的关系

　　见表2。ET1阳性组MVD为27.21±3.72，明显高于ET1阴性组，差异有显著性(P<0.05);TSP1阳性组MVD为21.12±3.27，TSP1阴性组MVD为34.54±2.87，两组间MVD的差异有显著性(P<0.05)。值得注意的是，在15例ET1表达阳性且TSP1阴性表达的癌组织中，MVD明显增高(45.13±3.15)。线性回归分析也发现MVD与ET1表达水平呈正相关，与TSP1表达水平呈负相关。表2 ET1、TSP1的表达与MVD的关系(略)

　　3 讨 论

　　肿瘤的发生、发展均有赖于肿瘤组织的血管生成。新生肿瘤血管可持续不断地为肿瘤细胞提供营养及氧气，带走肿瘤代谢产物，并为肿瘤的血行及淋巴道转移提供途径，因此血管新生为肿瘤的治疗提供了一个靶向。但肿瘤的血管新生是一个复杂的过程,受多种正负血管生成因子的调控,已发现的内源性血管新生调控物质有数十种。

　　ET1是由血管内皮细胞产生的一种缩血管多肽，它具有许多血管外功能，是细胞促有丝分裂原，参与细胞生长代谢，对细胞DNA合成、cfos、cmyc原癌基因表达、刺激胶原合成及细胞增殖都有一定的影响。目前已将ET1引入肿瘤学研究领域，并认为喉癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌等细胞株或肿瘤组织可产生内皮素。本实验结果表明在NSCLC中ET1主要分布于肿瘤细胞胞浆中，且在肿瘤组织血管及成纤维细胞中也有较强表达。ET1阳性表达与肿瘤分化程度有一定关系，肿瘤组织分化程度越高，ET1阳性表达率越低;而分化程度越低，ET1阳性表达率越高。ET1阳性组其MVD值明显高于其阴性组，提示ET1参与肺癌的血管生成。其机制可能与以下因素有关：①由于肿瘤细胞生长过快必然会造成组织严重缺氧，通过缺氧诱导因子1的介导，促进肿瘤细胞合成、释放ET1，刺激内皮细胞和平滑肌细胞的增生，因而触发了代偿性的血管再生〔3〕。②ET1还可诱导内皮细胞释放的基质金属蛋白酶2(MMP2)显著增加，有利于细胞外基质的降解，增加内皮细胞的迁移及侵袭能力。③ET1还可诱导内皮细胞的形态发生改变，如细胞伸长、促使相邻的细胞排列成直线，形成血管条索样结构。

　　TSP1是一种细胞外基质糖蛋白，是一种内源性的血管生成抑制因子。具有调节血小板聚集、细胞黏附、运动、生长的功能,并能抑制血管内皮生长和运动，诱导其凋亡，减少内皮细胞黏附和形成管状结构的能力,从而抑制血管生成及抑制肿瘤发生发展。TSP1 的抗血管生成活性已被许多体内外实验所证实。本实验中，NSCLC组较正常对照组的TSP1表达下降，TSP1表达缺失组的MVD明显增高,提示TSP1是NSCLC血管新生的重要抑制因子之一。并且TSP1的表达与淋巴结转移有关，提示TSP1表达下降在NSCLC侵袭力增加及转移中起重要作用，其低表达是提示预后差的一项指标〔4〕，为抑制NSCLC血管新生开发了新的治疗靶点。

　　本实验中值得注意的是，ET1是重要的血管新生诱导因子,在诱导NSCLC的血管新生过程中起重要作用;TSP1 则是主要的内源性血管新生抑制因子，TSP1表达的降低亦参与调节NSCLC 的血管新生过程。进一步分析ET1与TSP1表达对NSCLC血管新生的共同影响,发现NSCLC 的血管新生程度取决于ET1与TSP1的表达失衡。在15例ET1表达阳性而TSP1表达缺失的NSCLC中，MVD明显高于单一的ET1阳性或TSP1表达缺失组，推测ET1与TSP1可能具有协同作用，共同调节和诱导肺癌新生血管的形成，在浸润转移中起重要作用，联合检测有助于判断NSCLC的转移、侵袭力，为判断NSCLC分化程度和治疗转归提供一定的客观依据。

　　【参考文献】

　　1 许新华,胡国清,鲁明骞,等.肺癌组织中内皮素表达与DNA含量及预后的关系〔J〕.中国癌症杂志,2002;12(6):5002.

　　2 Urquidi V,Sloan D，Kawai K,et al.Contrasting expression of thrombospondin  1 and osteopontin correlates with absence or presence of metastatic phenotype in an isogenic model of spontaneous human breast cancer metastasis〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(1):6174.

　　3 Salani D，Taraboletti G,Rosano L,et al.Endothelin1 induces an angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo〔J〕.Am J Pathol,2000;157(5):170311.

　　4 Dudek AZ，Mahaseth H.Circulating angiogenic cytokines in patients with advanced non  small cell lung cancer：correlation with treatment response and survival〔J〕.Cancer Invest，2005;23(3):193200.