深低温保存对气管组织细胞活力的影响

　　作者：齐战,杨大运,高峰,张玉芬,王瑞,张泽峰　　作者单位：河北省医学科学研究重点课题计划项目(编号：07289) 050011 石家庄市，河北医科大学第四医院胸一科(齐战、高峰、张玉芬、王瑞、张泽峰)，呼吸内科(杨大运)

　　【摘要】 目的 探讨深低温保存对气管组织细胞活力的影响程度。方法 切取SD大鼠气管后立即放入含有新鲜配置的低钾右旋糖酐(LPD)溶液的冻存管，在程序降温仪降至-80℃后投入液氮中保存，分别保存24 h、15 d、30 d、60 d、120 d。然后对气管组织体外培养，加入3HTdR以做标记，最后使用β液体闪烁计数器检测组织细胞吸收情况。结果 与冷冻前比较，低温保存后气管组织细胞3HTdR掺入率降至75.3%～81%。冷冻15 d以后3HTdR掺入率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 深低温保存后气管组织细胞保留了70%～80%的活力，损伤主要发生在冷冻早期。采用3HTdR体外组织培养是检测气管组织细胞活力的有效方法。

　　【关键词】 气管,低温保存,活力,3HTdR掺入率

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of cryopreservation on the viability of tracheal tissue and cell in rats. Methods The tracheas from SD rats were removed and immersed immediately in low potassium dextran (LPD) solution. Then the sterile plastic tubes were sealed, and frozen up to -80℃ in a programmable freezer. The tubes were stored in liquid nitrogen for different time of preservation(24h，15d，30d，60d，120d). Then the specimens were cultured and labeled with 3HTdR in vitro in order to check the absorption of them,and the cells were counted by liquid scintillation counter. Results The average 3HTdR incorporation in the trachea after cryopreservation was decreased by 75.3%～81.0%,as compared with that before cryopreservation. There were no significant differences in 3HTdR incorporation 15d after cryopreservation among the groups. Conclusion After cryopreservation,the tissue and cells of trachea can maintain 70%～80% of viability. The damage of tracheal viability mostly occurs in the early stage of freezing. The measurement of 3HTdR incorporation is a reliable method as a marker of the viability of tissue and cells of trachea.

　　【Key words】 trachea; cryopreservation; viability; 3HTdR incorporation rate

　　许多研究证实同种异体气管经深低温保存后可以使其抗原性减低，减少移植后的排斥反应[1,2]。但是Kushibe等[3]研究发现随着冷冻时间的延长，出现气管上皮破坏和纤毛脱落，软骨活力降低，认为这是深低温影响了细胞功能和应激能力[4]。本文采用3H胸腺嘧啶核苷3HTdR体外组织培养的方法，对深低温保存后的气管组织在不同时间进行培养，探讨细胞活力的变化特点。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与试剂

　　1.1.1 实验动物：健康清洁级、近交系封闭群SD大鼠20只，体重200～240 g(河北医科大学实验动物中心提供，批号：DK03120006)。

　　1.1.2 试剂：新鲜配置低钾右旋糖酐(LPD)溶液400 ml，加入10%二甲基亚砜(DMSO)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 气管切取与保存：SD大鼠以氯胺酮麻醉，按150 mg/kg腹腔内注射，同时注射肝素钠200 U。麻醉平稳后仰卧位固定于特制手术台上，颈部垫高。严格消毒后取其气管，立即裁剪成5段，每段约1 cm，分别放入含有上述保存液的冻存管中(每管1段)，置于4℃冰箱冷平衡4 h，再于程序降温仪冷冻箱中程序降温，降温速率1℃/min至-80℃后投入液氮保存。

　　1.2.2 光学显微镜观察：将上述标本分别于保存后24 h、15 d、30 d、60 d、120 d随机各抽取10段进行光学显微镜观察(HE染色)，并以正常气管为标准进行对比。

　　1.2.3 气管组织细胞培养：将新鲜气管和保存后24 h、15 d、30 d、60 d、120 d的标本随机各抽取10段：37℃恒温浴箱融冻(3～5 min)，盐水漂洗10次后修剪为2 mm×2 mm×1 mm软骨块，置于24孔培养板内，每孔内100 mg，每瓶加入3 ml含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，先锋霉素V 4 mg，pH值调至7.3，放置在37℃ 5% CO2温箱内孵育24 h，然后每瓶加入3 μCi 3HTdR(山东大学实验核医学研究所提供)，继续孵育16 h，取出标本，立即送检。

　　1.2.4 同位素标记计数测定(酸性氧化法)：将每孔标本及培养液转移至相应编号的玻璃试管，2 000 g离心5 min，去上清后每管加入磷酸缓冲液(PBS)8 ml，再2 000 g离心5 min后去上清，然后每管加入80%甲酸0.1 ml，100℃水浴2 h后将消化液移入闪烁瓶(每瓶含闪烁液5 ml)，在β液体闪烁计数器上测量各瓶放射性。

　　1.3 统计学分析 计量资料以±s表示，计算出相应时段气管保存后占保存前3HTdR掺入率的百分比(%)，并绘出直方图，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 组织学检查 低温保存后的气管复温后和新鲜气管比较外观略显苍白，差异无统计学意义(P>0.05)。光学显微镜检查：整个观察期内，各组气管结构保持基本完整。但随着时间的延长，尤其15 d后出现纤毛脱落，30 d后开始出现部分上皮破坏，并逐渐加重，软骨环变化不大，但需要指出的是部分软骨在切片过程中存在人为破坏，为软骨较硬和切片较薄所致。见图1～3。

　　2.2 气管低温保存后3HTdR掺入率 冷冻15 d以后各组3HTdR掺入率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

　　2.3 气管低温保存时间与3HTdR掺入率变化关系 见图4。表1 气管低温保存后3HTdR掺入率检测结果注：冷藏前测定值=(35.24±3.20) cpm/mg

　　图1 气管低温保存24 h 形态学变化 (HE×10)图2 气管低温保存15 d形态学变化 (HE×10) 图3 气管低温保存60 d形态学变化 (HE×10)图4 气管低温保存时间与3HTdR掺入率变化的关系

　　3 讨论

　　随着低温冷冻技术的发展，气管经过长期低温保存后仍能成活已经见到诸多报道[1,2]。研究者认为这样不仅解决了新鲜器官的短缺，而且消减了它的抗原性[5，6]。但是气管通过深低温冷藏后，在基本保持原有结构的同时，多大程度上保留了组织细胞的活力和功能，这方面的研究却较少。然而移植前气管功能和活力的评估对这项技术的临床应用非常重要。

　　胸腺嘧啶是细胞分裂和增殖必需的原料，3HTdR能在细胞增殖过程中(DNA复制)合成到染色体中。细胞死亡后就不会吸收它，因此测定它的掺入率可以作为细胞活力的一个标志[7]。利用3HTdR体外气管组织培养的方法，可以分析低温保存后气管组织细胞的功能和活力。通过对检测结果分析发现，气管经过低温保存后24 h，其掺入率就明显减低，约为新鲜标本的81%，此后降低明显变缓，15 d后为75.3%，30 d后稳定在72%左右。这和Kushibe等[8]对低温保存后气管软骨活力测定的结果(67%～76%)略有出入，可能与他使用的是Na235SO4标记蛋白聚糖有关，国内难以买到此种试剂，且35S的半衰期较长，对人体危害较大。另外，还与保存液组成、降温程序、低温设备、保护剂的种类以及检测仪器等有关。分析气管组织细胞活力发生如此变化可能包括以下几个方面：(1)组织在周围温度骤降的情况下细胞内冰晶形成，引起细胞膜及其内在结构的损伤;(2)组织在周围温度降低到一定程度并稳定后，生物学代谢逐渐减慢，细胞的结构功能趋于稳定;(3)这种“稳定”似乎不是停止，随着时间的延长，细胞结构和功能的损伤仍在继续，可能非常缓慢，因此这种保存也不应是无限期的;(4)气管在复温过程中组织结构同样受到损伤。气管经过120 d的低温保存后仍保留了近70%的活力，这可能是实验和临床上利用该项技术移植气管成功最主要的依据。

　　低温冷藏技术保持了气管的完整结构和大部分活力，同时还减弱了组织抗原性。Inutsuka等[9]认为低温使气管上皮的破环是抗原性减弱的主要原因，然而Kushibe等[8]发现低温保存后气管软骨细胞的活力亦降低，抗原性亦减弱。作者认为这可能与两方面都有关，也许由于软骨抗原性弱而以上皮破坏的原因为主。另外，深低温保存后气管抗原性的减弱是否是以气管组织细胞活力的部分丧失为代价，这方面值得进一步探讨。利用3HTdR体外组织培养的方法比较准确地估计了低温冷藏后气管组织细胞的活力，为临床上器官的低温保存及移植提供了客观依据，同时为判断低温保护剂的效果、冷冻程序和保存期限开辟了一种新的方法。另外，3HTdR是一种释放微弱β射线的标记物，对人体危害很小，而且检测方便可靠，可以在临床上推广。但是此实验也存在着一定的局限性：(1)气管组织各种细胞都能掺入3HTdR，因此未能区分低温对某种细胞的影响程度;(2)实验条件控制不同，结果可能产生一定的差异。

　　【参考文献】

　　1 Tanaka H, Maeda K,Okita Y.Transplantation of the cryopreserved tracheal allograft in growing rabbits.J Pediatr Surg,2003,38:17071711.

　　2 Murakawa T,Nakajima J, Motomura N,et al.Successful allotransplantation of cryopreserved tracheal grafts with preservation of the pars membranacea in nonhuman primates.J Thorac Cardiovasc Surg,2002,123:153160.

　　3 Kushibe K,Tojo T,Sakaguchi H,et al.Effects of warm ischemia and cryopreservation on cartilage viability of tracheal allografts.Ann Thorac Surg,2000,70:18761879.

　　4 Kumon BC,Shiraishi T, Makihata S,et al.Cartilaginous injury limits cryopreservation of tracheal isograft.Respirology,2000,5:105110.

　　5 Nakanishi R,Onitsuka T,Shigematsu Y,et al.The immunomodulatory effect of cryopreservation in rat tracheal allotransplantation.J Heart Lung Transplant,2002,21:890898.

　　6 齐战，王善政，何奇，等.气管低温保存液中海藻糖浓度的选择.中华胸心血管外科杂志，2004，20：364365.

　　7 房澍名，姚冬梅，王军民，等.益肝康及其拆方对肝星状细胞活化增殖及胶原代谢影响的研究.河北医药，2008，30：14811482.

　　8 Kushibe K,Nezu K,Nishizaki K,et al.Tracheal allotransplantation maintaining cartilage viability with long-term cryopreserved allografts.Ann Thorac Surg,2001,71:16661669.

　　9 Inutsuka K,Kawahara K,Takachi T,et al.Reconstruction of trachea and carna with immediate or cryopreserved allografts in dogs.Ann Thorac Surg,1996,62:14801484