鳖甲煎丸对肾间质纤维化模型大鼠肾脏肾上腺髓质素及TGFβ1的影响

　　作者：韩琳 秦建国 任可 陈志强 许庆友 作者单位：北京中医药大学基础医学院，北京 100029

　　【摘要】 目的 观察鳖甲煎丸对肾间质纤维化大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)、转化生长因子(TGF)β1表达的影响。方法 SD大鼠采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法制备肾间质纤维化模型，将其随机分为鳖甲煎丸组、缬沙坦组与模型组，并设假手术组(分离输尿管后缝合腹部)。缬沙坦组、鳖甲煎丸组分别给予缬沙坦10 mg·kg-1·d-1、鳖甲煎丸1.6 g·kg-1·d-1灌胃，模型组和假手术组每日给予等容积的蒸馏水。所有动物于术后第14天断头处死，切取左肾，留取肾组织标本。采用免疫组化及RTPCR方法观察梗阻侧肾脏ADM、TGFβ1在蛋白及基因水平的表达，放射免疫法测定ADM在肾组织中蛋白含量。结果 模型组及各治疗组大鼠肾脏ADM蛋白含量、蛋白表达及mRNA的表达较假手术组明显降低，鳖甲煎丸组、缬沙坦组的含量均高于模型组(P<0.05);TGFβ1的蛋白及mRNA的表达各治疗组明显低于模型组(P<0.05)，鳖甲煎丸组、缬沙坦组两组之间比较无显著性差异。结论 鳖甲煎丸能够上调肾间质纤维化大鼠肾脏ADM的蛋白及mRNA的表达，下调TGFβ1的表达，对肾脏起到保护作用。

　　【关键词】 鳖甲煎丸,肾间质纤维化,肾上腺髓质素,转化生长因子β1

　　肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)是新发现的一种内源性血管活性肽,在心肾功能调节中发挥重要作用。最近研究发现ADM具有拮抗转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1，TGFβ1)的促纤维化作用而减轻肾小管间质的损伤〔1〕。大量动物实验显示，活血化瘀中药能抑制TGF的表达，对肾脏起到保护作用，但这种作用是否与其他血管活性肽的参与有关尚不清楚，为了证明其可能的作用机制，为临床用药提供理论和实验依据，本文采用单侧输尿管结扎方法制备肾间质纤维化模型，并给予活血化瘀、软坚散结的鳖甲煎丸，观察鳖甲煎丸对大鼠肾脏肾上腺髓质素及TGFβ1表达的影响，探讨鳖甲煎丸拮抗肾间质纤维化可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 雌性SD大鼠40只，体重(180±10)g，清洁级，由河北医科大学动物中心提供。

　　1.2 药物与试剂 鳖甲煎丸(杭州胡庆余堂制药厂生产)，缬沙坦(诺华公司提供)，大鼠ADM抗体(武汉博士德生物有限公司提供)，TGFβ1抗体(Santa Cruz 公司提供)，ADM放免试剂盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供。

　　1.3 模型的建立 实验过程中大鼠自由进食和饮水，分别置于代谢笼里取尿，检测尿蛋白和尿红细胞，结果均为阴性用于实验。将大鼠随机分为假手术组、模型组、鳖甲煎丸组、缬沙坦组，每组10只。大鼠给予10%水合氯醛以30 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，腹部切开，暴露左侧肾脏，分离输尿管，于中上1/3处结扎并剪断，使左肾完全梗阻。假手术组分离输尿管后缝合腹部。缬沙坦组、鳖甲煎丸组于术前1 d分别给予缬沙坦10 mg·kg-1·d-1、鳖甲煎丸1.6 g·kg-1·d-1灌胃，模型组和假手术组每日给予等容积的蒸馏水。所有动物于术后第14天断头处死，切取左肾，留取肾组织标本。按冠状位纵形剖开，置于4 %多聚甲醛(含0.1 % DEPC)中，石蜡包埋，留取部分新鲜肾组织匀浆采用放射免疫法测组织中ADM的蛋白含量，部分肾组织保留于-70℃冰箱中以备提取总RNA用于RTPCR。

　　1.4 肾组织中ADM含量的测定 于实验结束时剖杀动物取出肾组织，吸去血迹，称重，快速放入生理盐水1 ml轻轻研磨，然后在100℃水浴中煮沸10 min，再次研磨制成匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清-20℃以下保存。用放免药盒测定组织中的ADM的含量(按说明书操作),同时测定上清液中的蛋白含量给以校正。

　　1.5 ADM、TGFβ1免疫组织化学检查 采用DaKo Envision两步法。一抗为小鼠抗大鼠ADM抗体(1∶60)，小鼠抗大鼠TGFβ1抗体(1∶100)。显色系统为EnVisionTM+/HRP(DAKO公司产品)，每次染色均以PBS替代一抗作为阴性对照。ADM、TGFβ1在组织中的表达通过在肾脏任意选取40个高倍视野(×400)使用半定量分析方法评为0～4级，0级：无表达;1级：局部弱阳性表达;2级：局部中度表达;3级：局部强阳性表达或广泛弱阳性表达;4级：广泛强阳性表达。以每个高倍视野平均得分标准进行比较。

　　1.6 ADM、TGFβ1mRNA水平的测定 ADM、TGFβ1半定量mRNA测定采用RTPCR检测，按照Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)说明书方法提取肾组织总RNA，按逆转录试剂盒(Promega公司，美国)说明书逆转录合成cDNA，以等量的cDNA为模版进行PCR反应，ADM引物序列：上游5′GTGGAATAAGTGGGCGCTAA3′，下游5′GCTGAGTGTGTCTGCTCCTG3′;片段大小为410 bp(由上海生物工程公司合成)。TGFβ1引物序列：上游5′TAATGGTGGACCGCAACAACG3′，下游:5′TGGCTGTACTGTGTGTCCAG3′，片段大小为680 bp(由大连宝生物工程公司设计合成)。同时扩增大鼠βactin 用作内参照，大鼠βactin 引物序列：上游5′GCCATGTACGTAGCCATCCA3′，下游 5′GAACCGCTCATTGCCGATAG3′，扩增片段大小为375 bp。ADM、TGFβ1基因扩增条件为：变性：94℃ 30 s、45 s;退火：54℃ 30 s 、50℃ 45 s(35个循环);延伸：72℃ 5 min。最后取20 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶图像分析系统(GelPro Analyzer Version 3.0)分析结果。

　　1.7 统计学处理 数据资料以x±s表示，采用SPSS11.0 软件分析结果，组间比较采用单因素方差分析，两组均数间差别的显著性用t检验。

　　2 结果

　　2.1 肾组织ADM蛋白含量 假手术组大鼠肾组织中肾上腺髓质素含量为(9.59±1.83)ng/g，模型组含量为(4.13±0.34)ng/g，模型组与假手术组相比有显著性差异(P<0.001);鳖甲煎丸组ADM蛋白含量较模型组升高，为(5.74±1.04)ng/g，与模型组比较有显著性差异(P<0.05);缬沙坦组的含量亦高于模型组，为(5.61±1.94)ng/g，与模型组比较有显著性差异(P<0.05);鳖甲煎丸组的含量高于缬沙坦组，但两组比较无显著性差异(P=0.916)。

　　2.2 ADM、TGFβ1免疫组化表达 ADM在假手术组表达较为广泛，在皮质及髓质均有表达且以髓质表达为明显，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆，模型组ADM的表达明显减弱，在髓质肾小管上皮细胞无阳性表达，仅在皮质部分区域有微弱表达。鳖甲煎丸组ADM的表达明显增强，在皮质及髓质的肾小管上皮细胞胞浆广泛表达，肾小球有微量表达,与模型组比有显著性差异(P<0.05﹚;缬沙坦组ADM的表达较模型组亦明显增强(P<0.05)，但缬沙坦组与鳖甲煎丸组相比无显著性差异(P=0.197)。TGFβ1免疫组化结果显示假手术组肾小管为弱表达，结扎输尿管后表达明显增强，鳖甲煎丸、缬沙坦治疗可下调其表达。见表1。

　　表1 ADM和TGFβ1免疫组化检测结果(略)

　　与模型组比较：1)P<0.05，下表同

　　2.3 ADM mRNA半定量RTPCR结果 假手术组mRNA水平表达最高，模型组表达明显降低，鳖甲煎丸、缬沙坦治疗可上调其表达，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，鳖甲煎丸组ADM mRNA的表达略高于缬沙坦组，但两组间比较无显著性差异(P=0.814)。TGFβ1检测结果显示，假手术组为弱表达，结扎输尿管后表达明显增强，鳖甲煎丸、缬沙坦治疗可下调其表达，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)(见表2，图1)。

　　A 假手术组，B 模型组，C 鳖甲煎丸组，D 缬沙坦组

　　图1 ADM和TGFβ1 mRNA在SD 大鼠肾脏的表达(略)

　　表2 ADM和TGFβ1 RTPCR 检测结果(略)

　　3 讨论

　　ADM是1993年日本学者Kitamura等从人的嗜铬细胞瘤中分离出一种新的活性多肽，肾脏是ADM分布较高的器官之一〔2〕。ADM通过调节肾脏血流量和肾小球滤过率，抑制细胞增殖以及抑制系膜细胞、小管上皮细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的迁移等对肾脏的功能起调节作用〔3〕。有研究表明，在胚胎发育过程中，ADM和TGFβ1的表达在时间和空间类型上都具有惊人的相似性，即它们在胚胎发育过程的相同时期出现，并且在组织和细胞内的定位亦相同，这些研究提示，ADM与TGFβ1之间可能存在着某种关系〔4〕。TGFβ1作为一种功能复杂的细胞因子，在脏器硬化过程中起着促进细胞外基质(ECM)沉积的作用。我们的前期实验采用ADM基因敲除小鼠复制肾间质纤维化实验动物模型，观察在ADM基因缺失状态下细胞增殖的变化，观察与野生小鼠的区别以及血管紧张素II受体拮抗剂的治疗作用，结果显示肾上腺髓质素在细胞增殖过程中起着重要的作用，并对TGFβ1的蛋白及基因表达有抑制作用，能够减轻肾间质纤维化的程度，ADM基因缺失小鼠较野生小鼠纤维化程度均明显，这种变化可被血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦部分抑制，这说明ADM与其有一定的交叉作用〔5〕，可能都是通过抑制TGFβ1的过度表达而实现的。另外，体外细胞培养证实，ADM不仅可以抑制血管紧张素Ⅱ的缩血管的作用，还可抑制其刺激血管平滑肌细胞增生的作用，采用血管紧张素Ⅱ刺激肾脏成纤维细胞，细胞增殖和细胞外基质的分泌异常增加，给以ADM治疗后，DNA的合成和细胞外基质的分泌都得以控制〔6〕。所以，寻找能够提高ADM的生物活性，增加ADM的生成的药物，在延缓肾间质纤维化的进程中有着重要意义。

　　中医药在肾脏疾病的治疗方面发挥了重要作用,大量现代化的研究手段揭示了中医药治疗肾脏疾病的部分机理，但其与肾上腺髓质素的关系报道尚少。现代对此方的临床和实验研究多集中在抗肝脏纤维化研究方面，研究结果证实鳖甲煎丸可以通过抑制TGFβ1等细胞因子减少胶原的合成从而起到防治肝纤维化的作用〔7〕。但鳖甲煎丸由多种中药组成，靶点是多方面的，本实验观察了ADM和TGFβ1在单侧输尿管结扎大鼠肾脏中的表达以及鳖甲煎丸对其表达的影响，结果显示鳖甲煎丸可以增加肾组织中的ADM的蛋白含量，上调ADM在蛋白及基因水平的表达，下调TGFβ1在蛋白及基因水平的表达，这可能是中医药治疗肾脏疾病的可能作用机制之一。

　　【参考文献】

　　1 马春燕，王海燕.肾上腺髓质素拮抗转化生长因子β1的促纤维化作用及其机制〔J〕.中国病理生理杂志,2002;18(2):17680.

　　2 Kitamura K，Kangawa K，Kawamoto M，et al.Adrenomedullin：anovel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commum，1993;192 (2)：55360.

　　3 Jougasaki M，Wei CM，Aarhus LL，et al.Renal localization and action of adrenomedullin:anatriuretic peptide〔J〕.Am J Physiol，1995;268(4pt2)：F65763.

　　4 马春艳，王海燕.肾上腺髓质素在人肾小管上皮细胞系对转化生长因子β1的拮抗作用〔J〕.中华医学杂志，2001;81(8)：4769.

　　5 许庆友，丁英钧，朱 立.肾上腺髓质素基因敲除小鼠单侧输尿管结扎肾脏αSMA表达特点及缬沙坦的作用〔J〕.中国药理学通报，2006;22 (7)：81922.

　　6 Eto Y，Shimosawa T，Kosaku Hiroshi N,et al.Interaction between adrenomedullin and angiotensin II in DNA synthesis and extracellular matrix accumulation in cultured rat kidney interstitial cells〔J〕.Clin Exp Nephrol，2002;6:712.

　　7 赵治友，姚真敏，钟庆平，等.中药鳖甲煎丸抗肝纤维化作用的临床实验研究〔J〕.中西医结合肝病杂志，2001;11(3)：1369.