脑脊液腺苷脱氨酶联合实时荧光定量聚合酶链反应在老年结核性脑膜炎诊断中的应用

　　作者：王秋梅,董雅坤,李欣,刘宁　　作者单位：石家庄市，河北省胸科医院

　　【摘要】目的 探讨脑脊液腺苷脱氨酶(ADA)联合试时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术在老年结核性脑膜炎(结脑)诊断中的意义。方法 以我院近7年来收治的老年结脑107例为研究对象，随机分为对照组和试验组，对照组检测脑脊液常规、生化，试验组在此基础上利用酶比色法测定脑脊液ADA活性，利用实时荧光定量PCR技术检测脑脊液结核分枝杆菌DNA。结果 联合上述2项指标老年结脑的早期确诊率试验组(38.5%)明显高于对照组(14.5%)，差异有统计学意义(P<0.01)。中期确诊率试验组(67.3%)亦明显高于对照组(43.6%)，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。结论 脑脊液中ADA活性检测及脑脊液结核分枝杆菌DNA测定可明显提高老年结脑早中期确诊率。

　　【关键词】 脑脊液;腺苷脱氨酶;聚合酶链反应;老年结核性脑膜炎;早期诊断率

　　Application of adenosine deaminase in cerebrospinal fluid combined with real-time quantitative polymerase chain reaction in the diagnosis of elderly tuberculous meningitis

　　Wang Qiumei, Dong Yakun,Li Xin,et al.

　　Hebei Provincial Chest Hospital,Hebei,Shijiazhuang 050041

　　【Abstract】 Objective To investigate the clinical value of adenosine deaminase (ADA) combined with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) in cerebro spinal fluid in the diagnosise of the elderly tuberculous meningitis.Methods One hundred and seven elderly patients with tuberculous meningit were studied at our hospital in last seven years. They were randomly divided into control group and experimental group. Biochemical and conventional test of cerebrospinal fluid were deteced in all patients. Adenosine deaminase was measured by enzyme colorimetric method and mycobacterium tuberculosis DNA was measured by RT-PCR from cerebrospinal fluid in experimental group.Results The early metaphase diagnosis rate for elderly tuberculous meningitis in experimental group (38.5%) was significantly higher than that of control group(14.5%,P<0.01).The metaphase final diagnosis rate in experimental group (67.3%) was also significantly higher than that of control group(43.6%,P<0.01 or P<0.05).Conclusion Early metaphase final diagnosis rate for elderly tuberculous meningitis is increased by detecting ADA and mycobacterium tuberculosis DNA in cerebrospinal fluid together.

　　【Key words】 cerebrospinal fluid; adenosine deaminase; polymerase chain reaction; elderly tuberculous meningitis; early metaphase diagnosis rate

　　近年来，随着结核感染与发病的年龄向老年推移，老年结核性脑膜炎推移的发病率有增加的趋势[1]。老年结脑已成为威胁老年人健康的重症结核之一。早期诊断已成为降低老年结脑病死率及后遗症发生率的关键问题。由于老年人各器官反应性均降低，常规实验室方法诊断老年结脑的敏感性低，难以满足诊断老年结脑的需要。因此进一步探讨特异、灵敏、实用的实验诊断方法具有重要的意义。经本研究证明，联合应用脑脊液腺苷脱氨(ADA)活性测定及实时荧光定量PCR技术检测脑脊液结核分枝杆菌DNA对早期诊断老年结脑有良好的价值，报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 所选病例均为临床确诊的老年结脑患者，共107例，男68例，女39例;年龄60～84岁;平均年龄(68±4)岁。发热89例，其中体温在38.5℃以上30例，37.5～38.5℃者59例，不发热18例。62例有不同程度的头痛。呕吐58例，颈强直54例，意识障碍25例，颅神经麻痹18例，脑膜刺激征22例，瘫痪32例 ，尿潴留9例，面瘫5例。共济失调及癫痫各2例，脑疝15例，多脏器功能衰竭5例，呼吸衰竭2例，消化道出血2例。全部患者均行腰穿检查，脑脊液压力<180 mm H2O(1.96 kPa) 28例，脑脊液压力在180～300 mm H2O 43例，脑脊液压力>300 mm H2O 36例。 脑脊液检查细胞数(正常值0～8×106/L)>500×106/L 32例，<500×106/L 75例。蛋白定量(正常值0.2～0.4 g/L)<1.0 g/L 28例，1.0～3.0 g/L之间46例，>3.0 g/L 33例。氯化物(正常值120～130 mmol/L)<120 mmol/L 88例，>120 mmol/L 19例。送检脑脊液涂片50例，抗酸染色阳性8例。X线检查，确诊急性粟粒型肺结核42例，浸润型肺结核13例，22例肺内有纤维硬结灶或钙化灶。胸椎或腰椎结核12例，s椎旁脓肿2例。94例行脑CT检查，显示粟粒结节影24例，结核瘤9例，脑积水35例，脑梗死17例，无改变19例。

　　1.2 诊断标准[2] (1)颅压增高在1.96 kPa(200 mm H2O)以上;(2)脑脊液氯化物下降到120 mmol/L(6.5 g)以下时，且有逐渐递减或持续之趋势;(3)脑脊液糖含量下降到2.5 mmol/l(4.5 g)以下时，且有逐渐递减或持续之趋势;(4)脑脊液蛋白含量增高到1～3 g/L以上，且有逐渐递增之趋势;(5)脑脊液白细胞总数局限于(300～500)×106/L之间，持续时间较长以淋巴细胞、激活淋巴细胞为主的混合细胞反应;(6)脑脊液ADA活性增高;(7)脑脊液发现结核菌或PCR结核分枝杆菌DNA阳性。具有(1)(4)(5)(7)项可确诊，(1)～(6)项有肯定意义，(2)(3)(6)项具有参考意义。目前对于结脑的早期诊断很困难，何谓早期，尚无统一定义，我院专家组参考多部文献[3，4]，现应用于临床的分期诊断标准为：早期;发病1周内确诊者。中期;发病2周内确诊者。晚期;发病3周及以上确诊者。

　　1.3 对照选择方法 对所采集病历随机划分为对照组(55例)试验组(52例)，对照组采用脑脊液常规检验方法，试验组在常规检验基础上测定脑脊液ADA活性及应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测脑脊液结核分枝杆菌DNA。2组年龄、性别比、临床表现及影像学检查等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

　　1.4 仪器与方法 脑脊液ADA测定选用美国CI8200型全自动生化免疫工作站，试剂选用宁波美康生物科技有限公司生产的ADA检测试剂盒，采用酶比色法，按说明进行操作，共测定52份脑脊液，其中42份ADA活性增高，(正常参考值0～5 U/L)，平均值为(22.5±8.3)U/L。脑脊液PCR结核分枝杆菌DNA测定采用中山大学达安基因股份有限公司生产的DA7600型核酸扩增实时荧光定量检测系统，试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，共测定脑脊液52份，其中DNA阳性者47份。(脑脊液标本中DNA<50拷贝为阴性)，本组阳性结果的平均值为2.384E+D3±1.367E+D2。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS 10.0软件系统，经χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　早期确诊率对照组为14.5%(8/5)，试验组为38.5%(20/52)，2组相比差异有统计学意义(P<0.01)。中期确诊率对照组为43.6%(24/55)，试验组为67.3%(35/52)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　老年结脑诊断的早晚是决定其预后的关键问题。脑脊液是实验诊断结脑的理想标本[5]。但由于老年结脑大多脑脊液常规生化检查缺乏明显的三高二低(脑脊液细胞数增高、分类以淋巴细胞增高为主、蛋白增高、糖及氯化物降低)，抗酸染色及结核菌培养阳性率低，且培养时间长，需4～8周。因此，采用经典实验方法诊断老年结脑，这样的结果显然不能满足临床诊断的需要。本组结果表明，结核性脑膜炎患者脑脊液ADA活性明显增高。因ADA是一种巯基酶，广泛存在于机体各组织、细胞和体液中，与机体细胞免疫活性密切相关。文献报道，脑脊液ADA阳性率可达80%～90%[5]，本组老年结脑脑脊液ADA阳性率为80.7%，与文献报道相符[6]，可作为老年结脑早期诊断指标之一。在临床工作中，脑脊液中结核菌检查是早期确诊的最重要方法。但国内脑脊液中结核菌的检出率普遍很低，涂片阳性率为10%左右，培养阳性率为20%～30%，但在实际工作中阳性率更低[7]。因血行结核病多数是结核菌L型进入血液透过血脑屏障引起脑膜炎。脑脊液涂片或培养查不出结核菌，但实时荧光定量PCR能查出标本中极少量(10～20个)结核分枝杆菌DNA片段，能查出活菌、死菌、经治疗后的低活力菌与变异的L型结核菌。具有敏感、快速、高效、特异等优点，国内报道阳性率为51%～85%[8]。本组PCR结核分枝杆菌DNA检出阳性率为90.4%，较文献报道稍偏高，考虑与仪器改进标本封闭污染减少仪器自动计算标本中DNA拷贝数有关。本研究结果表明，联合脑脊液ADA及PCR结核分枝杆菌DNA测定，可明显提高老年结脑的早期确诊率，在临床工作中极具使用价值。

　　【参考文献】

　　1 俞伟帼，结核性脑膜炎的诊断和治疗.医学综述，2002，8：493-495.

　　2 李晓英，郝志芳，郑荣坤.结核性脑膜炎患者的护理体会.河北医药，2004，26：704.

　　3 卢延任.成人结核性脑膜炎早期诊断的调查.中华结核和呼吸杂志，1984，2：65.

　　4 张郭荣主编.结核病新概念.第1版.，北京：中国农业科技出版社，1985.48-62.

　　5 彭卫生，王英年等主编.新编结核病学.第2版，北京：中国医药科技出版社，2003，239-240.

　　6 王翠兰，刘梅仕，结核性脑膜炎脑脊液检测项目研究的进展，临床神经病学杂志，2002，15：314-316.

　　7 薛承岩，张茉莉，徐亚利，等.玻片直接离心集菌涂片法检测脑脊液抗酸杆菌，中华医学检验杂志，1999，22：245.

　　8 陈建新，文芳，等.聚合酶链反应分子灯塔法检测脑脊液结核分枝杆菌.卒中与神经疾病，2003，10：103.