肺炎支原体感染和耐药机制的研究现状

　　作者：刘军锋,贾克刚,刘运德　　作者单位：天津泰达国际心血管病医院检验科，天津

　　【关键词】 肺炎支原体,黏附蛋白,膜脂蛋白;23S rRNA基因;耐药

　　肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，Mp)是引起人类非典型性肺炎和许多呼吸道疾病的病原体之一，在获得性肺炎病例中约有10%～30%是由该病原菌引起的。肺炎支原体只能黏附在呼吸道上皮细胞表面，而不进入组织和血液中，通过宿主细胞吸收营养，并从宿主细胞膜获得脂质和胆固醇，继而释放出核酸酶及过氧化氢等有毒物质，导致细胞及机体的病理损害。黏附和定植在宿主细胞是Mp致病的关键，p1蛋白、p116蛋白、高分子量蛋白、p65蛋白等黏附蛋白发挥了重要作用。Mp膜脂蛋白可诱导某些细胞分泌细胞因子，如白细胞介素8(IL8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素10(IL10)、白细胞介素12(IL12)等，从而引起全身各系统的并发症，并以此加重机体的炎性反应。过分应用大环内酯类抗生素可使23 S rRNA基因发生选择性突变〔1〕，由此揭示了23 S rRNA基因突变是导致Mp耐药的因素之一。近年来，由于抗生素的大量使用和不规范治疗等原因，Mp耐药菌株逐年增加，多重耐药也明显上升，导致治疗难度加大。Mp的感染和耐药机制是当前研究的的热点，本文就Mp黏附蛋白、膜脂蛋白、23 S rRNA基因、核糖体蛋白L4和L22等领域的研究现状进行综述。

　　1 Mp感染机制

　　1.1 黏附蛋白 与宿主呼吸道上皮细胞的黏附是Mp感染和成功定植的关键，黏附是由Mp细胞的尖端样结构特殊的黏附细胞器完成的。对宿主细胞黏附起主要作用的黏附蛋白包括p1蛋白、p116蛋白、p30蛋白、高分子量蛋白(high molecular weight proteins，HMW)、p65蛋白等。Seto等〔2，3〕首先证实了黏附蛋白是按照一定次序组装到Mp上的，即先是HMW1，再是HMW3、p1、p90，最后是p65，用免疫荧光显微镜观察到在Mp黏附细胞器顶端中有3个独特的亚细胞蛋白定位点，即HMW1HMW3、p1p90p40和p30p65。

　　p1蛋白是Mp主要的保护性抗原和毒力因子，含有多个抗原决定簇，位于黏附细胞器的顶端，是一种对胰酶敏感的跨膜蛋白，介导与靶细胞的特异黏附过程。p1蛋白正确定位于黏附细胞器是其发挥黏附功能的前提。p1基因用限制性核酸内切酶酶切图谱分析可分为从A～N共14个区，其中F、G、L、M为单拷贝区，其余为多拷贝区。编码p1蛋白的结构基因在单拷贝区，位于Mp基因组的第180858～185741位，由4884个碱基组成。Mp在进化过程中染色体基因组减少了很多，其基因组中包含大量的重复序列，存在重复性和可塑性〔4〕。根据p1基因的限制性片段长度多态性(RFLP)将Mp分成两型：Ⅰ型是以M129菌株为代表的Group1，Ⅱ型是FH菌株为代表的Group2。p1蛋白的结构基因包含于5.6 kb的基因区内(EcoRI)，从第一个EcoRI酶切位点到nt580，Group1和Group2的核酸序列及蛋白序列相同;nt580到nt640，两组的基因序列中有三个核苷酸的差异,但蛋白序列相同;Group1的nt641至nt1110的核酸序列对应于Group2的nt641至nt1125，Group2在这一区域比Group1长出15个核苷酸，相应增加了5个氨基酸;Group1的nt2188至nt3456和Group2的相对应的nt2830至nt3480有90%的同源性，该区域Group2比Group1基因长12个核苷酸，多4个氨基酸;Group1的nt3457至p1基因的结尾，与Group2相对应的区域比较有3处以上的差异〔5〕。p1蛋白是Mp直接结合到宿主细胞受体分子的主要黏附蛋白，也是主要的免疫原，可刺激机体产生较强的免疫反应。目前应用p1蛋白的特异序列作为引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增来检测Mp的报道较多〔6，7〕。

　　p116蛋白含有1 030个氨基酸，分子量为116 kD，是由一段长3 093碱基对(bp)的开放阅读框(ORF)编码，由ATG起始密码子开始转录的3.7 kb的mRNA，在此基础上翻译为蛋白质。Svenstrup HF等〔8〕重组表达了几乎完整的p116蛋白，该重组蛋白能与Mp多抗反应，且重组p116蛋白的特异性多抗可以抑制Mp对肝癌细胞株Hep2细胞的黏附，证明p116蛋白是独立于p1蛋白之外的重要细胞黏附因子，且具有较强的免疫学活性。此外该多抗还与致病株FH反应，且不与生殖器支原体交叉。

　　p30蛋白在维持Mp黏附细胞器的细胞结构和生物功能以及单向移动方面起重要作用，p30蛋白缺失的突变株并不影响p1蛋白在黏附细胞器上定位，p30蛋白与p1蛋白、p40蛋白、p90蛋白所组成的复合物是受体识别所必需，这一复合物可使Mp有效黏附于宿主细胞。

　　高分子量蛋白(HMW)包括HMW1、HMW2和HMW3，是由肺炎支原体两个非连锁基因位点编码的，这些蛋白参与或协助Mp的细胞黏附作用。HMW1有一近似胞浆域和一跨膜结构，此亚结构分布可使HMW1在支原体膜和细胞骨架之间形成链接，而这是黏附细胞器正常形成和发育的关键。HMW1是其他黏附蛋白定位的基础，其最先被安装到黏附细胞器上，定位于黏附细胞器基底附近。HMW2是p1蛋白正确定位所需，HMW2与HMW1的缺失将无法使p1蛋白有效地从胞浆池定位到细胞骨架结构，最终不能到达Mp细胞表面。Willby MJ 等〔9〕研究显示HMW1是HMW2定植在Mp黏附细胞器上所必需的。Balish等〔10〕推测HMW2是黏附细胞器的电子密度核成分。HMW3蛋白为高度疏水性并含有大量脯氨酸，HMW3缺失可使p65蛋白的水平下降、使p65蛋白定位变得更加模糊、使p1蛋白无法聚集在黏附细胞器，进而导致Mp细胞黏附性下降。p65蛋白分子量为65 kD，编码基因为p65操纵子的第一个基因，与编码HMW2蛋白的基因紧密相邻。p65蛋白是Mp细胞骨架的构成部分，如果HMW1或HMW2蛋白部分或完全缺失，将导致p65蛋白含量极低并不能正确定位，而且无论是移码突变还是转座子插入引起的HMW2缺失，都会导致细胞黏附蛋白HMW1、HMW3和p65水平下降，并使Mp失去细胞黏附能力。

　　1.2 膜脂蛋白 Mp感染除了引起原发性非典型性肺炎、咽炎、气管炎、支气管炎等呼吸道感染外，还可引起全身各系统的合并症〔11〕。支原体的免疫活性物质主要存在于膜脂蛋白中，在体外具有诱导人单核/巨噬细胞分泌TNFα、IL1β的能力〔12〕。Kazachkov等〔13〕研究表明，Mp及其胞膜物质在体外可以活化人单核巨噬细胞并诱导其产生TNFα、IL1β、IL10、IL12等多种前炎性细胞因子。其活化机制是巨噬细胞通过其胞膜上的Toll样受体2(TLR2)识别Mp膜脂蛋白成分，并完成信号转导过程。在识别Mp膜脂蛋白的过程中，TLR2起着主要作用：TLR2超表达而Toll样受体6(TLR6)表达缺陷的人胚肾293(HEK293)细胞受到巨噬细胞活化脂肽2(MALP2)刺激后，同样可以通过TLR2介导NFκB活化并释放前炎性细胞因子;而TLR2受体被阻断后的单核细胞对Mp膜脂蛋白的反应性明显受到抑制〔12，14〕。

　　Chmura等〔15〕实验证明人的支气管上皮细胞在Mp抗原的刺激下，IL8的分泌明显增加，且与感染的抗原量呈量效关系。Sohn等〔16〕实验结果也显示Mp能显著诱导肺腺上皮癌细胞株A549细胞IL8的分泌，且分泌的IL8的量与Mp的感染程度具有一定的相关性。Mp诱导的A549细胞IL8的产生与细胞外信号调节激酶(ERK)的活化途径有关，使用丝裂原活化激酶(MAPK)/ERK的抑制剂PD98059可明显的降低Mp诱导的IL8的表达〔16〕。国内研究显示〔17，18〕，A549细胞、人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞受到Mp膜脂蛋白作用后，细胞膜结合型细胞间黏附分子1(mICAM1)的表达水平明显上调，且对Mp膜脂蛋白具有浓度依赖性，随着Mp膜脂蛋白作用时间的延长，A549细胞、ECV304细胞mICAMI表达水平逐渐上升，作用16 h达到高峰，然后下降。说明Mp膜脂蛋白中的脂质成分可以诱导A549细胞、ECV304细胞mICAM1表达水平上调，在很大程度上影响着Mp所致炎性反应的强弱。

　　2 Mp的耐药机制

　　由Mp感染的某些病人长期用药治疗可引起临床患者对大环内酯类抗生素的耐药。从临床病人标本中分离出的Mp，发现有1/3感染支原体的病例在23S rRNA基因发生了点突变〔1〕。由此提示过分应用大环内酯类抗生素可使23S rRNA基因发生选择性突变，从而导致Mp对大环内酯类抗生素的耐药。

　　Matsuoka等〔19〕在76株耐药Mp中分离出13株对红霉素耐药，其中12株高耐药，最低抑菌浓度(MIC)均大于256 μg/ml,1株低耐药(MIC=8 μg/ml)，对红霉素耐药的13株Mp核苷酸测序显示，23 S rRNA基因功能区Ⅴ中，10株在2 063位发生A→G突变，1株在2 064位发生A→G突变，对红霉素低耐药株在2617位发生C→G突变;在23S rRNA基因功能区Ⅱ和核糖体蛋白质L4和L22没有发现突变。

　　Morozumi等〔20〕研究显示，12株对6种大环内酯类抗生素(阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、西他霉素、四环素、左氧氟沙星)耐药的Mp(MIC≥1 μg/ml)中，有11株在23 S rRNA基因功能区Ⅴ发生2 063位A→G突变和2 064位A→G突变。由红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、奎奴普丁/达福普汀、替利霉素诱导M129的变异株在23 S rRNA基因功能区Ⅴ发生两点突变，即2 611位，C→A突变;2 062位，A→G突变。由氯洁霉素、替利霉素诱导M129的变异株，在核糖体蛋白质L4有单个氨基酸的改变(H70R或H70L),同时加入链阳性菌素，其诱导的变异株，在60位会插入一个、二个或三个连续的氨基乙酸〔21〕。

　　Stakenborg等〔22〕的实验表明，十六元环大环内酯类抗生素对Mp耐药菌株的MIC浓度为8～16 μg/ml,而对敏感菌株的MIC仅为0.03～0.125 μg/ml，十五元环大环内酯类抗生素和氯洁霉素对Mp耐药菌株的MIC浓度超过64 μg/ml，而对敏感菌株仅为0.06～0.5 μg/ml。Mp对十四元环大环内酯类抗生素的耐药是由于23 S rRNA基因发生2 057位G→A的突变，另外，对大环内酯类耐药的Mp中亦发现23 S rRNA基因发生2 058位A→G的点突变，但其核糖体蛋白质L4和L22没有发生变化。Okazaki等〔22〕在体外红霉素诱导产生的耐药Mp中，11株均有23 S rRNA基因点突变，3株发生2 063位A→G突变，5株发生2 064位A→G突变，3株发生2 064位A→C突变。

　　3 结 语

　　本文从Mp的p1蛋白、p116蛋白、高分子量蛋白、p65蛋白等方面阐述了Mp黏附蛋白的研究现状，随着从分子水平对Mp黏附细胞器研究的深入，可进一步探知黏附蛋白的致病机制，为Mp感染疾病的治疗及预防提供理论依据。Mp膜脂蛋白越来越受到关注，通过Mp膜脂蛋白可探讨炎性反应机制。对大环内酯类抗生素耐药的Mp是近年研究的热点，23 S rRNA基因突变是导致Mp耐药的因素之一，随着认识的深入，从基因水平的全面研究一定会取得新进展，从而解决临床因Mp耐药而带来的治疗问题。

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