老年人β2肾上腺素能受体单倍型/多态性与支气管哮喘关系的研究

　　作者：邱玉英,殷凯生　　作者单位：江苏省南京市，南京大学医学院附属鼓楼医院呼吸科 ;江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院呼吸科

　　【摘要】目的 研究老年人群β2肾上腺素能受体(β2AR)基因的单核苷酸单倍型/多态性与支气管哮喘的关系。 方法 用直接DNA测序法测定了70例哮喘患者和112例健康体检者β2AR 5个位点 (-47,-20,46,79,252)的单核苷酸多态性(SNPs)，并确定单倍型。 结果 哮喘组及对照组5个位点的基因型分布频率的差异无显著性(P>0.05);所有测定对象中发现3个常见的纯合型单倍型，分别为TTACG、TTGCA和CCGGG;46与79位所组成的单倍型与其他3个位点的之间存在着明显的连锁不平衡。 结论 β2AR单倍型/多态性不是老年人哮喘发病的遗传决定因素，β2AR基因5个位点之间的连锁不平衡性可能影响哮喘的临床表现。

　　【关键词】 β2AR基因,哮喘,单倍型; 多态性

　　【Abstract】　Objective To analyze the relationship of single nucleotide polymorphisms (SNPs) /haplotypes of beta2-adrenergic receptor(β2AR )gene and bronchodilator asthma in elderly people. Methods Five SNPs (in positions:-47,-20, 46, 79, 252) genotypes of β2AR gene among 70 asthma cases(asthma group) and 112 controls were determined by direct DNA sequencing, and haplotypes were detected. Results There was no significant difference in genotype distribution of five SNPs between asthma group and control group (P>0.05). Three common haplotypes TTACG,TTGCA and CCGGG were found in all study population;There were significant linkage disequilibrium between haplotypes of the polymorphisms in position 46 and 79 and the rest three loci(P<0.01). Conclusions β2AR polymorphisms /haplotypes are not genetic determinants of susceptibility to asthmatics in elderly people, linkage disequilibrium among β2AR gene 5 loci might affect disease manifestation.

　　【Key　words】 beta2-adrenergic receptor; asthma; haplotype; polymorphism

　　β2肾上腺素能受体(β2AR)基因是目前受到广泛关注的哮喘候选基因。它于1987年被克隆和测序，位于第5号染色体5q31-32[1]，这是一个与哮喘及其临床表型相关的区域[2-3]。β2AR基因编码区有2个常见的非同义单核苷酸多态性(SNPs)，即46A/G(Arg16Gly)和79C/G(Gln27Glu)。大多数对这2个多态性的功能研究表明，Gly16与促进β2AR下调有关，而Glu27则抵抗受体的下调[4]。另一个重要的SNP位于β2AR调控区-49位上，碱基T突变为C[5]，导致β2AR基因5′上游多肽(BUP)最后一个氨基酸即-19位上的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys),从而影响β2AR的表达。重要的是5′-前导区(5′-LC)这一多态性与β2AR编码区16位和27位存在着明显的连锁不平衡。

　　本研究采用DNA测序法测定老年人β2AR基因编码区及调控区5个位点-47 T/C、 -20 T/C、 46 A/G、 79 C/G 和 252 G/A的基因型，进而确定单倍型，并确定β2AR基因5个位点之间的连锁不平衡程度。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　这是一项以人群为基础的病例对照研究，本研究共包括182例居住在南京地区的老年人，其中哮喘组70例，均符合支气管哮喘的诊断标准，其中男34例，女36例，年龄60~68岁，平均(63.2±5.6)岁;对照组112例，来自本院的健康体检者，其中男55例，女57例，年龄60~65岁，平均(60.7±4.8)岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 β2AR基因多态性的检测采用PCR及DNA直接测序法：(1)每个受试者均抽血5 ml，用微量DNA抽提试剂盒抽提其基因组DNA;(2)包含β2AR基因5个位点-47 T/C、 -20 T/C、 46 A/G、79 C/G 和252 G/A的710 bp片段的扩增[6]：上游引物：5′CACCACAGCCGCTGAATGAGG 3′，下游引物：5′GGCTTGGTTCGTGAAGAAGTC 3′，反应条件：预变性94 ℃，90 s，变性94 ℃，45 s，退火68 ℃，90 s，延伸72 ℃，4 min，共30个循环，最后在72 ℃延伸8 min;(3)这710 bp的PCR片段以试剂盒纯化并用荧光标记法测序，不能确定的标本再进行双向测序。

　　1.2.2 统计分析:计算各组基因型频率及等位基因频率，确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡;β2AR基因多态性位点基因型频率及等位基因的频率比较用卡方检验;位点之间的连锁不平衡用确切概率法分析。所有的统计在SPSS 11.5中进行。

　　2 结果

　　2.1 2组β2AR 5个位点的基因型频率比较

　　每个基因型位点的频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，哮喘组及对照组5个位点的基因型分布频率的差异无显著性(P>0.05)。表1 2组β2AR 5个位点的基因型频率比较(略)

　　2.2 所有测定对象5个位点基因型组合的分布频率，共有8种基因型组合，其中3个为纯合型单倍型，分别为TTACG(58例),TTGCA(18例)和CCGGG(2例)，共78例。表2 2组β2AR基因5个位点的基因型组合 (了) 注：Het为杂合型

　　2.3 在78例纯合单倍型中, 46与79位点所组成的单倍型与其他3个位点之间存在的连锁不平衡，经确切概率法检验,-47、-20、252位点上的2个等位基因与3种单倍型之间具有明显的连锁不平衡(P均<0.01)。表3 β2AR基因46与79位点的单倍型与其他多态性的相关性(略)

　　3 讨论

　　目前在β2AR基因编码区及调控区共发现13个SNPs，编码区9个。编码区的2个常见的非同义SNP，即46位和79位上的A突变为G和C突变为T，导致16位上Arg突变为甘氨酸(Gly)和27位上的谷氨酰胺(Gln)突变为谷氨酸(Glu)。大多数对这些多态性的功能研究表明，Gly16与促进β2AR下调有关，而Glu27则抵抗受体的下调[4]。起动区有8个突变位点，其中有一个可导致氨基酸序列的改变，即β2AR转录体mRNA的5′未翻译区有一个5′-LC，内含一小段开放性阅读框架(ORF)，编码一个19个氨基酸多态(BUP)，这一区域有一个常见的多态性，即在-47位上的T 代替C，导致编码的-19位上Arg到Cys的改变[5]。体外研究表明这个多态性改变了β2AR mRNA的翻译，调节着β2AR表达，即Cys19能增强β2AR表达，而 Arg19则抑制受体的表达[5]。重要的是5′-LC这一多态性与编码区16位和27位存在着明显的连锁不平衡。

　　本研究首次在老年人群中用DNA测序法进行β2AR 5个位点(-47 T/C、-20 T/C、46 A/G、 79 C/G 和 252 G/A)多态性/单倍型与哮喘表型的相关研究。研究的结果表明β2AR的5个位点的基因型在哮喘组与对照组之间分布频率的差异无显著性，这与国内报道的相一致[7]。有报道白种人各位点的基因型分布频率差异有显著性(P<0.01)[8-9]。这说明人种不同，基因型的分布频率也不同。为了消除杂合型基因型确定单倍型的不准确性，单倍型的确定采用5个位点均为纯合型的基因型来分析，在所研究的人群中共发现3个常见的单倍型，分别为TTACG,TTGCA和CCGGG，这3个单倍型可以从46A/G(Arg16Gly )和79C/G(Gln27Glu)这2个位点来确定,即Arg16/Gln27、Gly16/Gln27、Gly16/Glu27。我们在所有受试者中未发现Arg16/Glu27这一单倍型，这与国外的研究完全一致[10]。本研究发现β2AR调控区与编码区之间存在着明显的连锁不平衡，如-19位上为Arg，其编码区的16和27位上必为Gly16Glu27;而-19位上为Cys，其编码区的16和27位上大部分为Arg16Gln27，小部分为Gly16Gln27。β2AR单个SNP不能预测其复杂的单倍型，但从这2个位点(46和79位)而无需从所有5个位点的基因型组合来确定单倍型可以在一定的可信区间内预测所有的的β2AR单倍型。

　　本研究发现老年人β2AR单倍型/多态性不是哮喘发病的遗传决定因素，β2AR基因5个位点之间的连锁不平衡性可能影响哮喘的临床表现。这要求将来的研究能否将这些发现应用于临床，并能确定所有β2AR的单倍型/多态性，特别是β2AR的3′端的SNPs以预测与哮喘及其表型关系。

　　【参考文献】

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