海藻糖浓度与气管低温保存疗效分析

　　作者：齐战,王会生,杨大运,郭杨,姚继方　　作者单位：石家庄市，河北医科大学第四医院胸外科　，呼吸内科　;河北省迁安市人民医院普外科

　　【摘要】 　　目的 探讨在气管低温保存液中海藻糖的最佳浓度。方法 新鲜配制4组保存液，均含10% DMSO，分别加入不同剂量海藻糖：Ⅰ组0.05 mol/L，Ⅱ组0.10 mol/L，Ⅲ组0.20 mol/L，Ⅳ组0.30 mol/L。切取SD大鼠气管后立即分别放入含上述4种溶液的冻存管，在程序降温仪降至-80℃后投入液氮中保存，分别在24 h、20 d、60 d、120 d后对气管组织进行HE染色和Bcl2、Bax蛋白检测(免疫组化)。结果 在气管保存后不同时点，4组细胞Bcl2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);在不同时点，Ⅰ组软骨细胞Bax蛋白表达均较Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间软骨细胞Bax蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在气管低温保存中，海藻糖的保护作用主要是通过对软骨细胞的保护实现的，抑制软骨细胞Bax基因的表达是其中的保护机制之一。海藻糖在0.10～0.2 mol/L范围内对气管的低温保存效果最佳。

　　【关键词】 海藻糖,气管低温保存,Bcl,2基因,Bax基因

　　海藻糖是一种天然的生物大分子非特异性保护剂，在病毒、疫苗保存等中已有广泛应用[1]。一些研究已经证明了它在气管低温保存中的保护作用，并且初步分析了其保护机制[2，3]。对于海藻糖在气管低温保存中的最佳浓度，我们曾经做过分析[4]，但作用途径尚不清楚，本文通过不同浓度的海藻糖溶液低温保存气管，然后进行Bcl2和Bax蛋白检测，了解在低温中海藻糖浓度与组织细胞凋亡的关系，以期探讨它的作用机制。报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康清洁级、近交系封闭群SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只，体重200～240 g(河北医科大学实验动物中心提供)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂：新鲜配置LPD液400 ml，加入10%二甲基亚砜(DMSO)，分为4份(每份100 ml)，加入不同剂量海藻糖(上海试剂二厂)：Ⅰ组0.05 mol/L，Ⅱ组0.10 mol/L，Ⅲ组0.20 mol/L，Ⅳ组0.30 mol/L。

　　1.2.2 实验方法：①SD大鼠以氯胺酮麻醉，按150 mg/kg腹腔内注射，同时注射肝素200 U。麻醉平稳后仰卧位固定于特制手术台上，颈部垫高。严格消毒后取其气管，立即裁剪成每段5个软骨环，放入含有上述保存液的冻存管中，置于4℃冰箱冷平衡4 h，再于程序降温仪冷冻箱中降温(1℃/min)，至-80℃后投入液氮保存。②将上述4组标本分别于保存后24 h、20 d、60 d、120 d随机各抽取5段进行光镜观察(HE染色)，并以正常气管为标准进行对比。③将保存后24 h、20 d、60 d、120 d气管标本同样抽取5段经中性甲醛(10%)固定，常规石蜡包埋，每个样本随机切取4张切片(5 μm厚)，进行Bcl2、Bax蛋白检测(SABC法，免疫组化试剂购自福建迈新)。光学显微镜下(×40)胞浆中见棕黄色颗粒者为Bcl2、Bax蛋白表达阳性。应用图像系统分析仪将每张染色后的切片上、下、左、右四区域分别随机摄取2个视野(共计8个)，计数单位面积内阳性反应细胞数所占比例(%)。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义 。

　　2 结果

　　2.1 光学显微镜检查

　　Ⅰ组气管结构保持较差，部分上皮破坏并与固有层分离，纤毛脱落较多，且这种变化随着时间延长而明显加重，60 d后几乎完全剥脱。软骨形状改变，有核软骨细胞数目很少。Ⅱ组和Ⅲ组气管结构保持完整，假复层柱状上皮保持良好，纤毛排列尚规则，随着时间延长仅有部分纤毛脱落。软骨有核细胞数目较多，结构变化不大。Ⅳ组气管结构基本完整，偶有上皮脱落，纤毛脱落稍多。软骨结构和有核细胞数目与Ⅱ、Ⅲ组相近。

　　2.2 免疫组织化学检查

　　Bcl2蛋白表达：Ⅰ组气管上皮大部缺失，剩余上皮明显表达，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组气管上皮保持较好，但均明显表达。气管其他结构(包括软骨细胞)表达均较低，各组间无明显区别。Bax蛋白表达：Ⅰ组剩余上皮明显表达，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组上皮绝大部分已经着色，各组间区别不大，同时上皮由于存在脱失导致无法准确计数。但是，各组软骨细胞Bax蛋白表达却明显不同，且容易计数。其他气管结构Bax蛋白表达不明显。因此，将软骨细胞的凋亡比例作为各组保存疗效的判断标准。

　　2.3 保存后不同时点气管软骨细胞Bcl2蛋白检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.4 保存后不同时点气管软骨细胞Bax蛋白检测结果。　

　　3 讨论

　　低温保护剂是低温医学的必备用品，DMSO是目前已广泛应用的保护剂之一。但一些研究发现即使保存液中加入10% DMSO，低温保存后气管软骨活力只有保存前65%～80%[5，6]。近年来一些国内外学者把海藻糖作为低温保护剂保存组织器官，取得了满意的效果[2，7，8]。我们选择不同浓度的海藻糖保存液对气管进行低温保存，在不同时间使用免疫组化的方法观察组织细胞凋亡的情况，并结合HE染色判断海藻糖浓度与保存疗效的关系。

　　关于海藻糖对生物分子的保护机制，目前主要有两种假说。一种称“水替代”学说和“玻璃态”学说[8]。王连召等[9]用含海藻糖保存液低温保存气管8个月后进行电镜(扫描和透射)和酶学(LDH和SDH)检查，发现与冷冻1 h相比仅有微小的变化，证实了它对气管组织结构的保护作用。细胞凋亡存在于多种生理变化过程中，有关它在器官保存和移植中的研究已见报道。Bcl2和Bax是一对最为密切的凋亡基因，在细胞凋亡的调控中起着十分重要的作用，两者作用不同，Bcl2抑制细胞凋亡而Bax促进细胞凋亡。Beattie等[10]曾在人胚胎胰腺细胞培养和保存中加入海藻糖，提高了细胞的成活率，发现海藻糖可抑制细胞凋亡。我们使用上述四种保存液保存气管，在不同时间观察Bcl2和Bax蛋白表达情况，发现4组Bcl2蛋白虽然随着时间延长表达增加，但4组间无明显区别(包括上皮和软骨细胞)。4组气管上皮Bax蛋白表达区别不大，但各组软骨细胞却明显不同，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组比较在不同时点差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。上述结果说明：(1)海藻糖对气管组织细胞抗凋亡基因Bcl2影响不大;(2)海藻糖抑制软骨细胞促凋亡基因Bax表达从而保护软骨活性;(3)海藻糖抑制Bax表达与浓度有关，0.05 mol/L疗效较差;(4)0.10 mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L疗效相近，浓度增加，疗效并没有提高，因此，0.10～0.20 mol/L比较合适。关于海藻糖抑制软骨细胞Bax表达的机制可能包括：(1)海藻糖是一种细胞膜保护剂，在低温中可以替代水分子与细胞膜磷脂结合，阻止细胞外凋亡信号的传递;(2)稳定细胞膜成分的分子结构(如骨架蛋白)，减少细胞膜本身变化产生的凋亡信号;(3)海藻糖对于线粒体膜亦有保护作用，抑制PT孔开放，减少细胞凋亡;(4)进入细胞内的少量海藻糖可能抑制BaxBax同源二聚体形成，阻止细胞凋亡。

　　另外Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组虽然上皮保存较I组完整，但Bax蛋白表达在上皮细胞中却没有明显区别，分析原因：(1)上皮细胞比较脆弱，容易受到缺血、低温等因素损伤;(2)在低温过程中海藻糖对上皮细胞的保护作用有限，上皮细胞内和细胞间不可避免地形成冰晶，引起上皮损伤。Bujia等[11]证实人类气管上皮和混合性腺体组织表达MHC Ⅱ类抗原，上皮缺失是低温可使同种异体气管移植成功的关键，因为表达MHC Ⅱ类抗原的细胞对于同种异体抗原的识别和排斥反应的发生至关重要，缺失这些具有重要免疫学特性的细胞将明显减弱同种异体移植物的排斥反应。Aoki等[12]得到类似结果，同时认为低温保存20 d以上可使气管上皮脱失。Tojo等[13]证实低温保存后移植气管的上皮起源于受体气管上皮，而软骨仍来源于供体。上述研究说明低温后供体软骨抗原性减低、上皮细胞缺失和受体气管上皮在供体气管迅速生长可以减低移植物抗原性。我们研究结果显示海藻糖在提高气管保存效果的同时不影响移植成功率，原因：(1)它对上皮的保护作用非常有限;(2)它对气管软骨保护作用良好，因为它抑制软骨细胞Bax蛋白表达，减少细胞凋亡。

　　至于0.05 mol/L海藻糖抑制Bax效果较差的原因可能包括：(1)浓度过低，不能与气管组织细胞膜充分结合，从而组织结构在低温中受到损伤;(2)浓度过低，形成“玻璃态”能力差，在低温过程中不能维持气管组织细胞的空间结构。上述原因造成细胞膜不能阻止细胞外凋亡信号传递;(3)细胞结构损伤自身产生凋亡信号，诱导凋亡。虽然0.30M海藻糖保存效果较0.05 mol/L明显提高，但与0.10 mol/L、0.20 mol/L无明显区别，甚至抑制作用稍差，原因可能如下：(1)浓度过高，可能抑制细胞表面生物大分子(如各种酶)的活性，使组织细胞活力降低;(2)海藻糖是细胞膜保护剂，DMSO是细胞内保护剂[7]，如果海藻糖浓度过高，附着在细胞膜上，可能减少DMSO进入细胞内，降低DMSO的保护作用;(3)浓度过高引起渗透性细胞内水分丢失，造成细胞损伤。

　　通过以上实验可以得出：在气管低温保存中，海藻糖的保护作用主要是通过对软骨细胞的保护实现的，抑制软骨细胞Bax基因的表达是其中的保护机制之一。海藻糖在0.10～0.20 mol/L 范围内对气管的低温保存效果最佳，这与先前的研究结论基本吻合[4]。

　　【参考文献】

　　1 Crowe JH，Crowe LM，Oliver AE，et al.The trehalose myth revisited：introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state.Cryobiology，2001，43：89105.

　　2 Yokomise H，Inui K，Wada H，et al.Longterm cryopreservation can prevent rejection of canine tracheal allografts with preservation of graft viability.J Thorac Cardiovasc Surg，1996，111：930934.

　　3 齐战，王勇杰，王善政，等.海藻糖在气管低温保存中的保护机制.中国海洋药物，2005，24：1720.

　　4 齐战，王善政，何奇，等.气管低温保存液中海藻糖浓度的选择.中华胸心血管外科杂志，2004，20：364365.

　　5 Kushibe K，Nezu K，Nishizaki K，et al.Tracheal allotransplantation maintaining cartilage viability with long-term cryopreserved allografts.Ann Thorac Surg，2001，71：16661669.

　　6 齐战，杨大运，高峰，等.深低温保存对气管组织细胞活力的影响.河北医药，2009，31：20432045.

　　7 齐战，王勇杰，王善政，等.在低温保存中海藻糖对气管组织细胞活力的影响.中国海洋药物，2005，24：2225.

　　8 齐战，杨大运，王善政.海藻糖在器官组织保存中的应用.国外医学呼吸分册，2005，25：210212.

　　9 王连召，周刚，王化冰，等.深低温冷冻保存气管的实验研究.中华外科杂志，2002，40：636.

　　10 Beattie GM，Leibowitz G，Lopez AD，et al.Protection from cell death in cultured human fetal pancreatic cells.Cell Transplant，2000，9：431438.

　　11 Bujia J，Wilmes E，Hammer C，et al.Tracheal transplantation：demonstration of HLA class II subregion gene products on human trachea.Acta Otolaryngol(Stockh)，1990，110：149154.

　　12 Aoki T，Yamato Y，Tsuchida M，et al.Successful tracheal transplantation using cryopreserved allografts in a rat model.Eur J Cardiothorac Surg，1999，16：169173.

　　13 Tojo T，Kitamura S，Gojo S，et al.Epithelial regeneration and preservation of tracheal cartilage after cryopreserved allograft in the rat.J Thorac Cardiovasc Surg，1998，116：624627.