骨桥蛋白与急性肺损伤

　　作者：邓莉萍　　作者单位： 四川，泸州医学院附属医院呼吸内科

　　【关键词】 骨桥蛋白,肺损伤,细胞因子

　　急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)是一种由多种效应细胞及炎症介质介导的瀑布样炎症性疾病，各种肺内外因素引起肺内多种炎症介质的释放，引发致炎因子与抗炎因子失衡导致肺内过度、失控的炎性反应，形成恶性循环，加重机体损伤。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是由巨噬细胞、平滑肌细胞(SMC)、T淋巴细胞、成纤维细胞等分泌的一种酸性糖蛋白，被称为早期T淋巴细胞活化因子，对细胞趋化和粘附、细胞因子的表达、免疫应答及炎症反应等有重要调节作用，参与机体炎症反应，调节细胞之间的平衡。现就OPN与肺损伤细胞因子之间关系的研究进展做一综述。

　　1　骨桥蛋白

　　1.1　骨桥蛋白来源与结构

　　OPN作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织(如骨骼、肾脏、肺脏、肝脏、膀胱等)和细胞(如破骨细胞、神经细胞、上皮细胞，淋巴细胞等)中，其中巨噬细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等在一些诱导因素下可以大量表达，正常体液中也有OPN的表达，其相对分子质量约为44 kDa，约含300个氨基酸残基。骨桥蛋白多肽链的二级结构中包括8个α螺旋和6个β折叠结构，高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列两端各有一个β折叠结构，分子中心部位是a螺旋结构。骨桥蛋白分子中具有RGD序列、凝血酶裂解位点、基质金属蛋白酶(MMP)作用位点、非RGD细胞粘附位点、钙离子结合位点。

　　1.2　骨桥蛋白生物学特征

　　OPN的RGD序列对于OPN的粘附功能发挥重要作用，可与细胞表面整合素受体 avβ、avβ3、avβ5等结合，介导糖蛋白与细胞间的粘附过程。RGD序列具有高度保守性，一旦变异或缺失将丧失其促粘附的功能。凝血酶裂解位点可以将OPN裂解为45KD及24KD两个片段，其中45KD片段OPN促进粘附能力反而加强。目前发现OPN分子中存在3个MMP-3上的酶切位点和2个MMP-7的酶切位点[1]，同凝血酶的功能相似，OPN经MMP酶切后其诱导巨噬细胞迁移的功能明显加强。在非RGD细胞粘附位点中，OPN以非RGD依赖方式与细胞表面CD44结合而发挥细胞信号分子的作用，介导信号转导并能诱导NF-ΚB活性，同时通过细胞间的信号传导影响肿瘤的发生与转移。OPN作为一种细胞因子可以促进TH1型细胞因子而抑制TH2型细胞因子的表达。细胞所分泌的OPN有磷酸化与非磷酸化的两种形式，其磷酸化与其功能密切相关，磷酸化后的OPN与细胞表面整合素受体结合，而未磷酸化的OPN则能与CD44受体结合，发挥不同的生物学效应。

　　1.3　骨桥蛋白的表达与调节

　　骨桥蛋白的表达受许多因素的调控，包括磷酸化修饰及外部生长因子、基因产物的调控等，许多激酶对骨桥蛋白中某些氨基酸的不同部位发生磷酸化，这可能与组织特异性有关。而感染和损伤可以促进T淋巴细胞与巨噬细胞上调OPN的表达，而低氧、高浓度的葡萄糖、高盐饮食、性激素、肾素血管紧张素系统等等均能刺激OPN的表达，TGF-β诱导OPN基因转录、转化生长因子β(TGF-β)和内皮生长因子(EGF)均能诱导OPN基因的表达。

　　2　骨桥蛋白与急性肺损伤

　　2.1　骨桥蛋白与多形核白细胞

　　大量研究表明多形核白细胞(PMN)是细胞损害和肺损伤的主要效应细胞，ALI/ARDS患者肺部滞留了大量多形核白细胞并出现凋亡延迟，有实验证明肺损伤时PMN所占细胞灌洗液中细胞总数比例上升至55%～90%[2]，滞留在肺组织中的多形核白细胞释放大量的氧化剂、溶酶体酶、氧自由基等造成肺损伤，并且当多形核白细胞粘附至内皮细胞后其细胞毒性增加，氧自由基的释放增加约1000倍。多形核白细胞与内皮细胞活化，释放各种粘附分子，(如ICAM-1、VCAM-1、P选择素等)，粘附分子是内皮细胞活化的标志，介导了两者的粘附，促进多形核白细胞的迁移和渗出，而整合素同样属于一种粘附分子，提供了第二个粘附位点，使多形核白细胞更加牢固粘附到内皮细胞上。白细胞存在β1、β2、β3整合素受体，而OPN主要通过β1、β3整合素受体以及CD44受体介导白细胞的粘附和迁移，大量的OPN可以促进白细胞附壁并向病灶处迁移。在刀豆蛋白A(ConA)诱导的肝炎模型中研究证明了OPN能放大NKT细胞的激活作用，增加巨噬细胞炎性蛋白2的分泌，这两者均可以促进中性粒细胞的活化与浸润[3]。所以，骨桥蛋白可能通过β1、β3、CD44受体及其他免疫细胞促进中性粒细胞活化、迁移，导致ALI。

　　2.2　骨桥蛋白与细胞因子

　　2.2.1　骨桥蛋白与NF-κB

　　NF-ΚB为一结构上相关联的蛋白质家族，NF-ΚB要发挥生物学活性，必须从胞浆中进入胞核，IΚB的主要功能是阻止NF-ΚB活化。NF-ΚB参与多种基因的转录调控，与炎症反应、细胞凋亡、免疫反应等多种病理过程关系密切。大量的实验表明，NF-ΚB的激活与ALI的发生有着密切的关系，在肺组织及肺泡灌洗液中均可检测出高表达的NF-ΚB 。用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对机械通气肺损伤及机械通气复合内毒素肺损伤均具有保护作用[4]。有报道认为OPN是一种抗凋亡因子，与αγβ3整合素受体结合活化NF-κB[5]。在肿瘤的发生发展中，OPN起着重要作用，多篇文献均有报道，OPN通过多种途径在肿瘤的发生发展中起作用，其中有诱导ras、酪氨酸蛋白激酶家族基因(Src)介导的NF-ΚB活化，上调血管内皮生长因子(VEGF)，促进肿瘤血管生成。有文献[6]证明OPN能以NF-KB依赖的方式上调pro-MMP-2表达，给予IkBa(NF-KB抑制剂)或MMP一2反义寡核苷酸，均能抑制肿瘤侵袭。有报道认为在B16F10细胞中，OPN能促使核因子诱导的NIK经αvβ3整合素介导的磷酸化加强NIK与IκB激酶作用，另外，OPN能诱导依赖NIK的NF-κB的激活[7]。在前列腺癌的研究中发现，NF-KB能促进前列腺癌的骨转移，但是这种转移能力并不是所有的前列腺癌细胞具有，而且这种潜在的转移能力与OPN的调节作用关系密切，可能与磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路有关[8]。所以，OPN能通过多种途径促进NF-κB活化，导致大量炎症因子产生，加剧肺损伤。

　　2.2.2　OPN与肿瘤坏死因子α

　　TNF主要由单核-巨噬细胞产生，TNF-α是感染后机体最早产生的炎症反应启动因子，又被称为：“早期反应细胞因子”诱导内皮细胞和巨噬细胞释放IL-1和其他促炎因子，导致肺内中性粒细胞的扣押和脱颗粒，导致肺损伤，而IL-1还可以加强ICAM-1 mRNA 的表达[9]，为肺血管内皮细胞损伤活化的标志物[10]。TNF-α还能促进血小板在肺内积聚、刺激肺血管内皮细胞合成前凝血质和纤溶酶原抑制物，导致凝血-抗凝血平衡失调，微血栓形成加重肺毛细血管通透性，同时抑制血管内皮细胞增生加强血管通透性，TNF-α还能使肺顺应性降低，均能促进ALI发生发展。TNF-α在脑损伤的研究中表明，TNF-α可以诱导花生四烯酸代谢物的释放和脂过氧化物及氧自由基的产生导致损伤[11]。经血凝酶酶切以后的骨桥蛋白，其N-末端片段能够与巨噬细胞表面的CD44受体结合，对巨噬细胞产生趋化作用;而C-末端片段能与细胞表面的整合素受体αvβ1相互作用，介导巨噬细胞的粘附与迁移，导致TNF-α表达增加[12]。 皮下注射OPN能够促进巨噬细胞向注射部位聚集，经静脉注入抗OPN抗体能抑制巨噬细胞的积聚[13]，降低TNF-α水平。在胆道闭锁发病机制的研究发现胆道上皮细胞有IL-2、TNF-α、OPN而且三者可以形成一种复合物，其较单独的细胞因子具有更强功能，且IL-2、TNF-α对OPN的表达具有协调作用[14]。较多文献均有证明OPN能促进TNF-α的表达，ECV304细胞能生成一定水平的OPNmRNA，若用LPS或TNF-α刺激ECV304细胞，OPNmRNA的表达上调[15]。在肿瘤微环境中的研究发现，TNF-α能促进OPN的表达，该过程是通过β1整合素介导的，若阻断β1整合素，则OPN的表达减低[16]。而在胶原诱导性关节炎中血清TNF-α的表达与OPN和αvβ3有关[17]。实验再一次证明了OPN能调节TH1/TH2型细胞因子平衡，促进TNF-α、IFN-γ的表达，而该过程可以被Anti-OPN-Ab所阻断[18]。所以，OPN可能诱导巨噬细胞的积聚，调节细胞之间的平衡，促进TNF-α的表达，加剧肺损伤。

　　2.2.3　骨桥蛋白与白介素1β(IL-1β)

　　IL-1主要由活化的巨噬细胞和内皮细胞产生，是肺损伤中主要的炎性因子，在肺损伤发生发展过程中，TNF-α是始动因子，而IL-1β则具有协同作用[19]。这些细胞因子可以诱导肺内皮细胞活化，促进细胞之间的粘附，吸引中性粒细胞的积聚并增加细胞毒性效应，也可以引起毛细血管通透性增强，肺水肿形成导致ALI，而肺水肿阻碍了肺泡通气与换气进一步加重肺损伤。OPN与IL-1β的表达在骨关节炎(OA)狼疮肾炎中表达均有升高，且随OA分级增加表达量呈正相关。OPN-/-小鼠急性炎症性肠病时IL-1β及基质金属蛋白酶的mRNA表达减弱[20]。然而有研究证明：OPN可以通过调节一氧化氮合酶(iNOS)的合成来调节NO的产生，在胰岛细胞抑制IL-1β诱导NO的产生而起到保护胰岛细胞受损的作用，而该过程是依赖RGD途径实现的，OPN可以通过减少IL-1β生成而抑制NF-κB的活化，所以骨桥蛋白对炎症具有双向调节作用。

　　2.2.4　骨桥蛋白与INF-γ

　　INF-γ是一类由活化的淋巴细胞分泌的细胞因子，正常肺组织表达量低，其含量与炎症反应密切相关。INF-γ具有强大的免疫调节功能，能促进TH0细胞分化为TH1细胞，并抑制TH2细胞增生，也能激活肺泡巨噬细胞促进炎症因子的表达促进肺损伤。INF-γ是前炎症因子，可以提高TNF-α等炎症因子的表达[22]，TNF-α也可以通过上调细胞的INF-γ受体数量，从而增强细胞对INF-γ的敏感性。在急性肺损伤中INF-γ表达升高，在SARS引起的肺损伤中发现病情危重者INF-γ表达进一步升高。OPN+/+与OPN-/-小鼠相比较，乙烯聚合吡咯烷酮(PVP)所诱导的OPN-/-小鼠INF-γ低90%，IL-12低95%[23]其可能机制是OPN与整合素受体结合诱导IL-12的表达，并通过与CD3的作用调节INF-γ的表达。在暴发型肝炎患者中，OPN表达明显高于急性、慢性肝炎及健康人群，推测OPN引起了IL-18、INF-γ作用[24]。在慢性鼻窦炎的发病中，OPN持续着色，同时发现，IL- 1β、INF-γ、TNF-α促进OPNmRNA的表达，但是IL-4、IL-13抑制OPN的表达，相反，OPN促进IL- 1β、INF-γ、TNF-α、IL-4、IL-13的表达[25]。

　　2.2.5　骨桥蛋白与IL-8

　　IL-8是患者发生ALI的潜在标志，实验证明在ARDS与ARDS高危患者肺泡灌洗液中存在IL-8，而且IL-8的浓度与中性粒细胞浓度成正相关。IL-8主要募集中性粒细胞，可以在肺内局部积聚而不被灭活，对中性粒细胞发挥持续趋化作用，而且其作用强于趋化因子C5a。IL-8也能促进粘附分子表达，增强内皮细胞与白细胞之间的粘附，并能促进白三烯的表达导致血管扩张，细胞液的外渗引起肺水肿导致肺损伤。IL-8在肺损伤时升高较TNF-α、IL-1β的升高晚，但是持续时间延长，说明IL-8可能在疾病的后期及预后上起着重要作用。在银屑病发病机制中发现，OPN可以通过整合素CD44调节TH1与TH2细胞因子的表达，促进TH1型细胞因子IL-8等的表达[26]。在狼疮肾炎的病理临床关系研究发现，OPN与临床活动指数、病理急性活动指数、血清IL-8水平均存在正相关，这可能与OPN诱导巨噬细胞释放IL-8等炎症因子有关[27]。在TNF-α刺激的肠上皮HT-27细胞中，OPN可以介导IKB的磷酸化，IL-8、MMP-7的表达增多，而且研究进一步发现，在TH27细胞TNF-α引起的NF-ΚB信号通路中，IL-8在MMP-7的上游[28]。

　　2.2.6　骨桥蛋白与IL-10

　　IL-10为主要抗炎因子，人缺乏IL-10将导致各种炎症过程。IL-10可以通过抑制Thl淋巴细胞产生致炎因子如IFN-γ、IL-2等，抑制单核巨噬细胞的激活及细胞因子的分泌，抑制T细胞的激活，抑制抗原递呈细胞共同刺激分子的表达来减轻肺损伤。Donnelly S C等研究证明，急性肺损伤患者肺组织中IL-10对抗中性粒细胞等炎症细胞在肺组织中浸润的作用，从而减轻肺损伤[29]。研究显示IL-10可强烈抑制TNF-a、IL-1、IL-6等炎症介质的合成。许多脂多糖致急性肺损伤动物模型均表明IL-10有抑制巨噬细胞、内皮细胞、组织成纤维细胞等诸多细胞释放致炎因子，从而减轻肺组织的损伤。AshkarS WeberGF研究发现，OPN具有调节免疫细胞细胞因子表达的能力，能促进TH1细胞因子的产生，而抑制TH2型细胞因子IL-10的产生。在体外培养的小鼠巨噬细胞中加入OPN,48小时后可能检测到高浓度IL-12，而检测不到IL-10，后来的研究进一步证实了OPN与CD44结合可抑制IL-10的表达[16]。我们推测：OPN能抑制IL-10的表达，减弱IL-10对肺脏炎症反应时的保护作用，间接促进炎症的发生发展。

　　3　展　望

　　ALI是由多种效应细胞及炎症介质导致瀑布样炎症的疾病，存在抗炎和致炎细胞因子失衡，在ALI发生发展过程中，肺组织产生大量促炎细胞因子，炎症的放大，同时抗炎因子IL-10的表达下降出现肺损伤。而骨桥蛋白(OPN)主要由活化的巨噬细胞、白细胞、肺泡上皮细胞等分泌，具有促进细胞的趋化粘附促进致炎细胞因子抑制抗炎因子的表达，同时过多的促炎因子如IL-1、TNF-α又可以促进OPN的转录，使OPN的表达升高，与细胞因子一起组成一个复杂的网络系统，因而，对OPN的有望成为ALI研究和防治的一条新途径。

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