核内不均一核糖核蛋白A2/B1及p53蛋白诊断肺癌的价值

　　作者：沈巨信,秦娥,孙健,周国忠　　作者单位：绍兴市人民医院呼吸科，浙江 绍兴

　　【摘要】 目的 探讨检测支气管肺泡灌洗液(BALF)脱落细胞中核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)A2/B1和血细胞中p53蛋白在肺癌诊断中的价值。方法 收集经病理确诊的肺癌患者30例BALF，以30例肺部良性疾病患者BALF为对照组，采用流式细胞术(FCM)，检测两组患者BALF脱落细胞中hnRNPA2/B1表达率及血中p53蛋白表达率。结果 肺癌组hnRNPA2/B1为(74.04±22.34)%显著高于肺部良性疾病组(28.03±9.01)%(P<0.01);hnRNPA2/B1水平与非小细胞肺癌临床TNM分期无关(P>0.05)。肺癌组p53蛋白水平为(2.16±1.88)%显著高于肺部良性疾病组(0.93±0.51)%(P<0.01);hnRNPA2/B1和p53蛋白诊断肺癌的敏感性分别为86.7%、70.0%，特异性为96.7%、83.3%;联合检测hnRNPA2/B1和p53的敏感性为93.3%，特异性为100%。结论 hnRNPA2/B1和血细胞中p53蛋白水平对肺癌有辅助诊断价值，尤其对早期肺癌的诊断有重要意义，两种指标联合检测可提高诊断敏感性。

　　【关键词】 肺癌,核内不均一核糖核蛋白A2/B1;p53蛋白;支气管肺泡灌洗液

　　近年的研究表明，核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)A2/B1在早期肺癌和癌前病变中过度表达〔1〕，比以往的细胞形态学检查有更高的敏感性。p53蛋白是肺癌相关基因p53基因编码的核酸蛋白，在癌变的早期阶段即可在血液中出现〔2〕。文献报道hnRNPA2/B1检测多采用免疫组化进行定性分析〔3，4〕，标本多为肺癌组织。本研究采用流式细胞术(FCM)检测肺癌患者支气管肺泡灌洗液(BALF)脱落细胞中hnRNPA2/B1及血细胞中p53蛋白水平，探讨联合检测hnRNPA2/B1和p53蛋白在肺癌诊断中的应用价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 肺癌组2006年5月至2007年8月本院呼吸科及胸外科确诊患者，共30例，男21例，女9例，年龄48～73〔平均(60.8±10.44)〕岁，所有入选的肺癌患者均经纤维支气管镜(简称纤支镜)肺活检、经皮肺穿刺活检、手术等组织病理学确诊，排除接受过放、化疗或肺癌手术患者，有严重心肺功能障碍不能耐受纤支镜检查者。其中鳞癌16例，腺癌8例，小细胞癌6例;按国际抗癌联盟(UICC1997)分期标准进行临床TNM分期，I期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。同期收集肺部良性疾病组30例为对照组，包括肺结核5例，支气管扩张6例，肺炎15例，慢性支管气炎4例，年龄46～71〔平均(58.0±11.66)〕岁，经细菌学、影像学、病理学确诊。

　　1.2 试剂及仪器 抗hnRNPA2/B1单克隆抗体试剂盒购自BD Biosciences公司，p53蛋白抗体试剂盒购自Cell Signal Technology公司。流式细胞仪由美国公司提供，型号为Coulter EPICSXL。

　　1.3 标本采集 所有受检对象均常规行Olympus T240纤支镜检查，按照中华医学会呼吸病学分会制定的肺泡灌洗常规检查方法进行支气管肺泡灌洗术(BALF)〔5〕，经负压吸引收集支气管肺泡灌洗液，离心沉淀后行FCM。纤支镜检查当日取患者肘静脉血5 ml，放置-20℃冰箱内保存待检。

　　1.4 检测指标

　　1.4.1 hnRNPA2/B1检测 取标本于10 ml离心管中，以2 500 r/min离心5 min，离心洗涤1次肺泡灌洗液，PBS制成悬液。加5 μl CD45PCY抗体反应5 min后，加破膜剂150 μl，摇匀后放置15 min，加FPBS离心洗涤，再加破膜剂250 μl，轻轻混匀放置5 min，加hnRNPA2/B1单抗25 μl(冰箱-20℃保存，取出后放室温消融)，轻摇1～2 s，放置15 min。加PSB离心洗涤，20 μl二抗IgGFITC，15 min。加PSB离心洗涤，上机。仪器方案“2006 hnrnpA2/B1”，计数1万个细胞中hnRNPA2/B1表达百分率作为观察数据。

　　1.4.2 外周血细胞内p53蛋白检测 采用双标法，取外周血2 μl，CD45PCY 10 μl+50 μl全血，避光反应15 min。PSB离心沉淀物制成悬液，用试剂intraprepTM(Immunotech公司)单细胞固定和破膜。加破膜剂150 μl，振荡后放置15 min，加FPBS离心洗涤，加破膜剂250 μl，轻轻混匀放置5 min，加10 μl p53(试剂瓶上的半量)轻轻摇匀1～2 s，放置20 min，加PSB离心洗涤，上机，仪器方案“2006p53”，计数1万个细胞中p53表达百分率作为观察数据。

　　1.5 统计学处理 计量资料用x±s表示，均数间比较采用t检验和χ2分析，以Excel2000建立数据库，应用ROC分析法综合评价诊断实验的实用价值。所有统计计算及绘图采用SPSS11.0系统软件完成。

　　2 结果

　　2.1 hnRNPA2/B1检测结果 肺癌组30例BALF脱落细胞中HnRNPA2/B1为(74.04±22.34)%，对照组30例(28.03±9.01)%，两组比较有显著差异(P<0.01)。肺癌组不同病理类型BALF脱落细胞中hnRNPA2/B1水平非小细胞癌24例为(81.17±17.92)%，小细胞癌6例(45.51±14.07)%，两者有显著差异(P<0.05)。 非小细胞肺癌不同TNM分期患者hnRNPA2/B1水平，Ⅰ～Ⅱ期13例HnRNPA2/B1(74.4±19.59)%，Ⅲ～Ⅳ期11例为(86.90±14.77)%，二者无显著差异(P>0.05)。

　　2.2 p53蛋白检测结果 肺癌组30例血p53蛋白为(2.16±1.88)%，对照组30例(0.93±0.51)%，两组患者p53蛋白水平比较差异显著(P<0.01)。肺癌患者血p53蛋白水平与病理类型的关系;小细胞癌6例〔(4.76±2.92)%〕;非小细胞癌24例〔(1.46±0.52)%〕，有显著差异(P<0.05)。

　　2.3 hnRNPA2/B1和p53蛋白对肺癌诊断的敏感性和特异性分析 若使用hnRNPA2/B1试剂进行检测，取诊断点为48.6，其诊断敏感性为86.7%，特异性为96.7%，准确率为91.7%，若单使用p53试剂进行检测，取诊断点为1.265，其诊断敏感性为70%，特异性83.3%，准确率76.7%，若联合两种检测指标(hnRNPA2/B1+p53)，其诊断敏感性为93.3%，特异性为100%，准确率93.3%。

　　3 讨论

　　hnRNP是一种RNA结合蛋白，hnRNPA2/B1则是hnRNP复合体的主要成分，由hnRNPA2和hnRNPB1组成，与肺癌密切相关。最近研究发现〔6〕，hnRNPA2/B1蛋白还可与端粒酶重复序列单链特异性结合，保护其免受核酸酶的分解，并激活端粒酶，现已明确，端粒酶的活性与细胞增殖有关，在肺癌的发生发展中起重要作用。研究提示〔7〕hnRNPA2/B1是一个较为敏感的肿瘤相关抗原，在肺癌病人癌前病变及肿瘤组织中高表达。

　　本实验结果提示肺癌患者BALF脱落细胞中hnRNPA2/B1水平升高，有助于肺癌的诊断。据文献报道，hnRNPA2/B1高表达与肺癌组织学类型无关〔3，4〕，而另一些学者认为鳞癌患者中表达最高〔7〕，本实验结果表明，非小细胞肺癌组hnRNPA2/B1水平高于小细胞肺癌组，有统计学差异，提示hnRNPA2/B1与肺癌病理分型有关，因小细胞肺癌病例数少，hnRNPA2/B1在肺癌病理分型中的意义尚需进一步扩大样本研究。

　　p53基因突变与肺癌之间存在相关性，有报道在小细胞肺癌患者中有90%～100%发生p53基因突变，在非小细胞肺癌的各种类型如腺癌、鳞癌等患者中p53基因突变率也达50%～60%，基因突变直接导致突变型p53蛋白高表达。p53蛋白作为一个细胞周期调控因子，在细胞增殖与凋亡的平衡上起着重要的作用，它的异常早于肿瘤的发生，可以早期检测p53基因的异常〔8〕。正常情况下，p53蛋白分泌较少，很不稳定，半衰期短，普通检测方法很难检测到。而突变型p53蛋白结构稳定，半衰期延长，可在胞内大量聚集，部分进入血液循环〔9〕。

　　本实验结果显示，两组患者p53蛋白检测水平比较差异有统计学意义，肺癌组水平显著高于对照组，提示该方法可用于辅助诊断肺癌。血p53蛋白水平在小细胞肺癌组与非小细胞肺癌组比较差异有统计学意义，小细胞肺癌组p53蛋白水平明显高于非小细胞肺癌组，推测是否与小细胞肺癌恶性程度高，增殖活跃(倍增时间为33 d)，早期发生血循转移，在外周血中出现癌细胞有关。本研究提示hnRNPA2/B1诊断准确性优于p53。而联合两种检测指，其诊断敏感性及特异性分别达到93.3%和100%，准确率93.3%，由此可见联合诊断准确性更高，更具有临床推广意义。本研究亦提示肺癌患者，NSCLC临床TNM分期的Ⅲ期～Ⅳ期hnRNPA2/B1水平与Ⅰ～Ⅱ期比较差异无统计学意义，提示hnRNPA2/B1水平与肿瘤负荷大小、有无远处转移关系不大，似乎该指标对临床分期无指导意义。故作者认为hnRNPA2/B1不随肿瘤发展的时期发生变化，说明hnRNPA2/B1在肺癌早期就已出现，是肺癌发生的早期指征。因hnRNPA2/B1反映的是代谢功能方面的变化，它可比形态学更早反映肿瘤的存在。而小细胞肺癌病例数少，本文未作分析，有必要扩大样本量进一步探讨hnRNPA2/B1与小细胞肺癌分期或病理分级的关系。

　　总之，hnRNPA2/B1和p53蛋白作为新型肿瘤标记物，在辅助诊断肺癌是可行的，hnRNPA2/B1作为一种肿瘤相关抗原，在癌前病变及肿瘤组织中高表达，敏感性较高，在NSCLC诊断价值较大，血p53蛋白特异性高，在SCLC诊断价值优于NSCLC。联合检测两种指标，可取长补短，提高肺癌诊断的准确率。另外，hnRNPA2/B1参与肺癌的发生发展，因此能否作为一个新的治疗靶点可能成为将来新的研究热点〔10〕。

　　【参考文献】

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　　10 陈明勇，李为民，徐 丹，等.抗核内不均一核糖核蛋白B1单克隆抗体结合(131)Ⅰ对肺癌小鼠靶向治疗结果〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2006;29(7)：48990.