慢性阻塞性肺疾病患者肺内细胞凋亡的研究

　　作者：石青　　作者单位： 重庆市铜梁县人民医院呼吸内科

　　【摘要】 目的 探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺内细胞凋亡情况，以其为临床治疗提供治疗靶点。方法 收集COPD患者和非COPD患者肺泡灌洗液，进行细胞培养，取上清液测定白介素8(IL8)和肿瘤坏死因子α(TNFα)含量，测定细胞凋亡率。结果 COPD组细胞培养上清液中IL8和TNF α含量明显高于对照组(P<0.05);COPD组肺泡巨噬细胞的凋亡明显高于对照组(P<0.05)。结论 COPD患者存在着强烈的炎性反应和细胞凋亡情况，可能是患者治疗靶点。

　　【关键词】 肺疾病,慢性阻塞性;细胞凋亡;白细胞介素8;肿瘤坏死因子α

　　【Abstract】 Objective To investigate the apoptotic state of pulmonary cells in patients with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) in order to provide therapeutic targets for clinical therapy. Methods The alveolar irrigating solutions of COPD patients and nonCOPD patients were collected,and the cell culture was performed,then the supernatant liquid was taken out to detect the contents of IL8 and TNFα,and the cell apoptosis rate was also detected. Results The levels of IL8 and TNFα in the supernatant liquid of cell culture in COPD group were significantly higher than those of control group(P<0.05).The apoptosis rate of alveolar macrophage in COPD group was significantly higher than that of control group(P<0.05). Conclusion The patients with COPD exist intensive inflammatory reaction and apoptosis,which may be a novel therapy target.

　　【Key words】 pulmonary diseases，chronic obstructive; cell apoptosis; IL8; TNFα

　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种呼吸系统常见疾病，具有较高的患病率和病死率。病理学研究表明，COPD患者存在着肺内细胞增殖和细胞死亡的平衡失调[1，2]。本研究对我院收治的COPD患者及非COPD患者，采集肺泡灌洗液，进行肺内细胞凋亡检测及相关分析，为发病机制及治疗提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 我院2006年3月至2008年9月收治的COPD患者20例，其中男13例，女7例;年龄35～69岁，平均年龄56.8岁。COPD患者均经肺功能检查确诊。排除支气管扩张、肺结核，且不伴有肺纤维化等其他急慢性疾病。对照组10例，男6例，女4例年龄32～71岁，平均年龄60.3岁。经体检发现肺部阴影，近2周内无呼吸系统感染，血常规检查未发现异常，均排除COPD。COPD患者FEV1/FVC(%)(第一秒用力呼气容积/用力肺活量)为(65.12±5.30)%，RV/TLC(%)(残气容积/肺总量)为(44.59±6.82)%。病理改变为飞跑间隔变薄、断裂，肺泡腔明显扩大等肺气肿改变。

　　1.2 试验方法 对2组患者进行支气管肺泡灌洗，将灌洗液置于4℃冰箱，两层无菌纱布过滤.低温离心机离心10 min。用含胎牛血清的RPMI培养液培养(含青霉素1×105 U/L、链霉素0.5×105 U/L)，调整细胞浓度为25×109/L，接种至96孔板中培养(COPD组和对照组各设6孔)，置37℃、5%CO2的培养箱中贴壁2 h，吸出上清液，测定上清液中白介素8(IL8)和肿瘤坏死因子α(TNFα)含量。96孔板继续用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗3次，除去未贴壁细胞。将一孔COPD组细胞爬片取出，40 g/L多聚甲醛固定10 min，储存于20℃冰箱备用。2组均加入含有2 mg/L地塞米松和100 g/L含胎牛血清的RPMI培养液，分别于12、24、48 h后取出细胞爬片，磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，40 g/L多聚甲醛固定10 min，储存于20℃冰箱备用。

　　细胞凋亡检测采用原位末端标记法：选择5个以上具有代表性的高倍视野(×400)，计数500个原位末端标记法染色阳性细胞数即细胞凋亡数，凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%;髓过氧化物酶染色阳性反应呈蓝色或蓝棕色颗粒，定位于细胞质中。检测步骤如下：细胞爬片置烤箱60℃ 1 h;二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化(100%、95%、80%、70%乙醇);蛋白酶K消化(20 mg/ml于10 mmol/L Tris/HCL，pH值7.4～8.0，37℃，30 min);PBS洗3次，5 min/次;切片浸入0.3%H2O2甲醇溶液1 h;PBS洗3次，5 min/次;滴穿透液0.1%曲酮X 100(溶于0.1%柠檬酸钠液中)2 min 4℃冰上操作;PBS洗3次，5 min/次;擦干标本周围，滴加30～50 μl TUNEL反应混和液;盖上盖玻片，置湿盒于37℃恒温箱1 h;PBS洗3次，5 min/次;擦干标本周围，加50～100 μl Converter POD盖上盖玻片;置湿盒37℃恒温箱30 min;PBS洗3次，5 min/次;加50～100 μl DAB底物液，室温10 min;PBS洗3次，5 min/次;部分苏木素、亚甲绿复染;常规脱水、透明、封片;镜下观察，计数。阳性对照:滴穿透液(0.1%曲酮～X100)后，用DNase(1 mg/ml，10 min，室温)诱发DNA链断裂作阳性对照。阴性对照:用50 μl标记液(不含末端转换酶)代替TUNEL反应混和液做阴性对照。细胞凋亡阳性判断标准：细胞核内出现棕黑色或黑色颗粒为阳性细胞。

　　上清液中IL8及TNF α的测定采用酶联免疫吸附法，利用生物素标记肽与样本中代测肽竞争性结合抗体的原理推算出样本中IL8及TNFα的含量。检测步骤如下：除空白孔外，分别将样本或不同浓度标准品(100 μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90 min;洗板4次;除空白孔外，加生物素化抗体(100 μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育60 min;洗板4次;除空白孔外，加入酶结合物(100 μl/孔);封住板孔，37 ℃孵箱孵育30 min;洗板4次;加入显色剂100 μl/孔，37 ℃避光显色15～20 min;加入终止液100 μl/孔，混匀后450 nm即刻测量OD值(5 min内)。空白孔仅加入底物和终止液，用以校准酶标仪的基准点。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，计量资料采用t检验，采用Pearson方法行线性相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞凋亡的形态学观察 在光学显微镜下，可观察到COPD组及非COPD组的凋亡细胞常单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状等典型的凋亡形态。

　　2.2 细胞凋亡结果比较 COPD组和对照组髓过氧化物酶染色阳性率分别为(1.56±0.47)%和(0.76±0.18)%差异有统计学意义(P<0.05)。COPD肺泡巨噬细胞的凋亡明显高于对照组(P<0.01)。COPD组和对照组肺泡巨噬细胞细胞凋亡率注：与对照组比较，*P<0.05;与普通爬片比较，#P<0.05

　　2.3 COPD组细胞凋亡与肺功能指标的相互关系 COPD组肺泡巨噬细胞的凋亡与FEV1呈负相关(r=-0.754, P=0.000);与FEV1/FVC(%)呈负相关(r=-0.912，P=0.000);与RV/TLC (%)呈正相关(r=0.304, P=0.000)。

　　2.4 2组IL8和TNF α含量 COPD组细胞培养上清液中IL8和TNF α含量与明显高于对照组 (P<0.05)。COPD组和对照组IL8和TNF α含量比较 ng/ml,±s注：与对照组比较，*P<0.05

　　3 讨论

　　目前关于肺气肿的发病机制学说有慢性气道和肺部炎症形成、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、以及氧化剂/抗氧化剂失衡[3，4]，这些学说主要强调气道上皮细胞和炎性细胞在发病中的作用，并不能充分解释肺气肿中肺泡间隔结构细胞进行性缺失的潜在机制;也无法解释具有与肺气肿相似机制参与的其他肺部炎症性疾病。病理学研究表明，COPD患者存在着肺内细胞增殖和细胞死亡的平衡失调。本研究发现患者肺泡灌洗液中存在细胞凋亡现象，且COPD组肺泡巨噬细胞的细胞凋亡明显高于对照组。凋亡细胞在光镜下,表现为核染色质致密浓缩，边缘化、核膜裂解、染色质分割成块状等典型的凋亡形态。这提示肺组织的细胞凋亡可能是的发病因素之一。

　　巨噬细胞通过分泌多种细胞趋化因子、蛋白酶及活性氧在COPD发病学中发挥关键的作用[5]。巨噬细胞释放的一系列炎症介质和氧自由基形成逐级扩大的瀑布样连锁反应。IL8，TNFα等细胞因子是启动抗菌炎症反应的关键因子，又称为前炎症细胞因子[6]。细胞因子、炎性介质相互诱导、相互作用，共同促进了COPD炎症的发展。TNFα在炎症过程中起重要作用。它主要由巨噬细胞产生，促进中性粒细胞释放IL8。本研究中比较COPD组和对照组患者的肺泡灌洗液中，巨噬细胞释放IL8和TNFα的水平，结果COPD组IL8和TNFα的水平明显高于对照组，表明COPD患者存在着更强烈的炎症反应。

　　肺泡巨噬细胞是一种多功能的间质细胞，除吞噬功能外还可分泌多种炎性介质，激发周围细胞共同参与调节COPD的免疫炎性反应，促进蛋白酶、趋化因子释放和更多中性粒细胞募集，也可释放蛋白酶，促进COPD发生[7]。本研究中COPD组肺泡巨噬细胞髓过氧化物酶染色阳性率降低，表明巨噬细胞吞噬异常、以及中性粒细胞凋亡参与了COPD的发生。巨噬细胞能特异性识别吞噬凋亡的中性粒细胞，作用机制尚不清楚，但炎症消散需要中性粒细胞及时凋亡和巨噬细胞正常吞噬[8]，而COPD 患者急性期外围血中性粒细胞的自发性凋亡下降。本研究中地塞米松能明显诱导肺泡巨噬细胞凋亡，这与临床上地塞米松治疗急性加重期COPD效果显著相符合，可能是地塞米松抗炎机制原因之一。

　　【参考文献】

　　1 刘凌云，曾勉.氧化应激与慢性阻塞性肺疾病.国外医学呼吸系统分册，2005，25: 733735.

　　2 王晓园，许西琳.慢性阻塞性肺疾病与细胞凋亡/抗凋亡的研究进展.临床肺科杂志，2007，12：958959.

　　3 Teresa D，Tetley.Macrophage and the pathogenesis of COPD.Chest, 2002，121: 156sI59s.

　　4 陈涛，吴亚梅.胶原酶/组织金属蛋白酶抑制剂1免疫活性及其在慢性阻塞性肺疾病非结构改变中的作用.中国呼吸及危重监护杂志，2004，3：3387391.

　　5 Barnes PJ.Macrophages as orehestrators of COPD.J COPD, 2004，1:5970.

　　6 张程，陈平，蔡珊，等.重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影响.中华结核和呼吸杂志，2007，30：432436.

　　7 曹国强，钱桂生，林莉，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织细胞凋亡和增殖的变化.中华结核和呼吸杂志，2005，28:16972.

　　8 Calabrese F, Giacometti C, Beghe B, et al.Marked alveolar apoptosis/proliferation imbalance in endstage emphysema.Respir Res，2005，6:14.