TGF-β1诱导肺泡上皮细胞间质转化

　　作者：黄振杰,郑金旭,莫凯天,苏石芳　　作者单位：广西北海市人民医院呼吸科;江苏大学附属医院呼吸科;上海市第八人民医院消化科

　　【摘要】 　目的：通过观察TGF-β1诱导下A549细胞出现的细胞形态学和E-cad表达的变化，探讨上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺纤维化发病机制中的作用。方法：体外培养A549细胞，以TGF-β1进行干预，收集不同时段的细胞，应用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测TGF-β1干预前后E-cad的mRNA表达变化;倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光观察E-cad蛋白表达的变化。结果：倒置相差显微镜观察到TGF-β1干预后A549细胞由鹅卵石状变为梭形，形态如同肌纤维母细胞。间接免疫荧光显示A549细胞的E-cad表达(红色荧光染色)随时间延长逐渐减少。RT-PCR显示E-cad的mRNA表达下调(P<0.05)。结论：TGF-β1在体外诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化,肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。

　　【关键词】 转化生长因子β1,A549细胞,上皮细胞间质转化,肺纤维化

　　Abstract：ObjectiveBy observing the cellular morphology changes and the expression of E-cad after A549 cells were treated with transforming growth factorβ1(TGF-β1)，to investigate the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the pathogenesy of pulmonary fibrosis.MethodA549 cells cultured in vitro were treated by TGF-β1,then harvested at different time points to assay mRNA expression of E-cad by real-time PCR (RT-PCR) before and after A549 cells being treated by TGF-β1.Cellular morphology changes were observed by phase-contrast microscope.Protein expression of E-cad by indirect immunofluorescence.ResultsAfter being treated by TGF-β1，A549 cells were observed by inverted phase contrast microscope to turn from pebble shape to fusiform shape，a myofibroblast-like morphology.Indirect immunofluorescence showed protein　expression of E-cad reduced as time went by(red stain).The mRNA expression of E-cad was down -regulated in RT-PCR(P<0.05).ConclusionTGF-β1 induced EMT of alveolar epithelial cells in vitro suggests that EMT of alveolar epithelial cells might be one of fundamental mechanisms of pulmonary fibrosis.

　　Key Words:Transforming growth factor β1;A549 cells;Epithelial- mesenchymal transition;Pulmonary fibrosis

　　特发性肺纤维化(IPF) 是最常见的肺间质疾病,也是肺间质纤维化的主要原因。多数肺间质疾病病因不明,其发病机制目前也未完全阐明。传统观点认为各种损伤因素损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，炎症细胞浸润，细胞因子失衡，肺实质损伤后继发肺间质细胞增殖过度修复导致纤维化。国外有文献报道IPF是一种涉及异常创伤愈合的功能紊乱，进行性的上皮损伤和(或)激活可能处于纤维形成和间质细胞增殖的核心位置，这种作用是不依赖于炎症的[1-2]。肺泡上皮细胞(AECs)不仅仅是作为发病的促动因素，它们本身就可以通过一个叫做上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程获得间质细胞表型而作为成纤维细胞和肌纤维母细胞的重要来源。在这个新的模式中，肺泡上皮应该被看作纤维化的关键环节之一，它作为一个“多能”的干细胞具有相当的可塑性，能参与到交替的途径中：上皮再生修复正常的肺泡结构，凋亡，或者通过EMT形成纤维化。本研究通过用TGF-β1诱导A549从肺泡上皮细胞向间质细胞转化，进一步探讨肺泡上皮细胞在肺纤维化发病中的作用,为阐明肺纤维化发病的分子生物学机制及寻求新的治疗方法提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及物品：A549细胞株(中国典型培养物保藏中心)，TGF-β1(PeproTech公司)， E-cad 鼠抗人一抗(Santa Cruz公司),兔抗鼠Fitc标志的IgG(Boster公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，低糖DMEM培养基(GIBCO公司)。MMLV逆转录酶(美国Promega公司)，实时定量试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invit rogen 公司)。

　　1.2 主要仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱 (Forma)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)，高速台式离心机(上海飞鸽牌)，Mx-3000P实时定量PCR仪(STRATAGENE公司)，凝胶成像与分析系统YNGENE (GENE)，电泳仪 Jim-X(Bio-Rad)，荧光显微镜(Leica)，荧光倒置相差显微镜(Nikon)。

　　1.3 细胞培养：A549细胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，常规培养于5%的CO2,37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。

　　1.4 倒置相差显微镜观察细胞形态：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,随机把细胞分组，于培养液中加入TGF-β1至终浓度5 ng/ml。倒置相差显微镜观察A549细胞在TGF-β1刺激0、24、48 h的形态变化。

　　1.5 间接免疫荧光：以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中预置的载破片上，细胞贴壁爬片后，用无血清培养基饥饿24 h后，加入TGF-β1至终浓度5 ng/ml。分别于0、24、48 h后，取出载玻片，用4%多聚甲醛固定60 min。5%的BSA封闭，37℃ 60 min。 加一抗E-Cadherin单克隆抗体(1∶50)， 4℃过夜。加相应二抗，缓冲甘油封片。荧光显微镜下观察，并拍照。

　　1.6 总RNA抽提及逆转录反应：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,在无血清培养基中加入TGF-β1至终浓度5 ng/ml。分别于0 、1 、3 、6 、12和24 h从六孔板中离心收集细胞,加入1 ml TRIzol Reagent,按其说明书操作步骤提取总RNA,电泳证实,具有清晰18S和28S条带的RNA用于逆转录实验,取1μgRNA经MMLV逆转录酶逆转录成cDNA。具体操作按试剂盒说明书进行。cDNA产物于-20℃保存。

　　1.7 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应( Real-time PCR)检测上皮细胞标志物E-cad的mRNA表达：RT-PCR检测上皮细胞标志物E-cad， APDH作内参。引物(Sequence 5′→3′)： E-cad Sense-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGT C-ntisense- ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-(147 bp);GAPDH Sense-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-Antisense-AGCCAATTCG TTGTCATAC-(115 bp)，引物由上海生工公司合成。加样体系按试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG说明书操作。实时定量PCR 反应条件：95℃ 5 min 1个循环，95℃ 20 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s，40个循环。由随机附带软件计算出Ct值和拷贝数。

　　1.8 统计学处理：各实验均重复3次，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 16.0软件处理，多组均数间采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验,P<0.05被认为是差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态学观察：与不加TGF-β1 组相比，加入TGF-β1 后，A549细胞由鹅卵石状上皮形态变成梭形、纺锤形，而且其细胞间隙略变大,细胞和细胞之间的连接变得松散。

　　2.2 间接免疫荧光：荧光显微镜下观察，正常的A549 细胞为鹅卵石状，细胞表达E-Cad 蛋白，胞膜可见耀眼的红色荧光染色，在外源性TGF-β1 刺激下，随时间延长细胞外形逐渐伸长，并与周围细胞分离，E-Cad 蛋白表达明显减少。

　　2.3 荧光实时定量PCR检测TGF-β1对A549细胞E-cad的mRNA 表达的影响：与不加TGF-β1 组相比，A549 细胞在加入TGF-β1 后其上皮细胞标志物E-cad的 mRNA 表达在24小时内总体呈现下调趋势，在第24 h时间点上最明显(P<0.01)，在第3 h时间点上出现一个短暂反弹(P<0.05)。

　　3 讨论

　　EMT是一种完全分化的上皮细胞经历细胞表型改变转化成完全分化的间质细胞的过程，通常转化成成纤维细胞和肌纤维母细胞[3]。EMT过程很久以来一直被认为在胚胎发育和恶性肿瘤的细胞转分化中起主导作用。外胚层在早期形成原间质的发育中经历了EMT过程。次级上皮通过间质细胞-上皮转化产生。这些次级上皮然后分化形成完全成熟的上皮，或者经历第二轮EMT形成各种各样的间质细胞和结缔组织细胞，例如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和成纤维细胞[4]。近年来发现EMT可以发生于多种生理、病理过程，不仅在胚胎发育、肿瘤转移级联反应的早期阶段起重要作用，还促进伤口愈合和多种器官的纤维化。

　　正常状态下上皮细胞通过细胞间黏附机制紧密连接在一起，E 钙黏蛋白(E-cadherin)是组成上皮细胞间紧密连接的重要成分，在保持细胞完整性和极性中起重要作用。TGF-β1 诱导的 EMT早期变化就是E钙黏蛋白表达受到抑制，也就是细胞间紧密连接的破坏,上皮细胞丧失黏附特性，逐渐从基底膜上脱落;然后胞质内细胞骨架进行重排,表达新的表型蛋白如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),胞质内肌丝也从上皮型的角蛋白(cytokeratin)转变为间质细胞的波形蛋白(vimentin)[5]。细胞形态由鹅卵石状变成梭形，类似成纤维细胞或者肌纤维母细胞，电镜下可见细胞极性发生改变，微绒毛消失，细胞内出现密体，胞质内出现大量肌动蛋白微丝。如果细胞在过渡阶段，两类细胞标志可同时表达。这些变化可能为细胞迁徙、收缩能力增强提供了形态学基础。

　　本研究中，A549细胞在5ng/ml TGF-β1的诱导下，上皮细胞标志物E-cad的mRNA 表达在24 h内总体呈现下调趋势，在第24小时时间点上最明显;间接免疫荧光也显示E-cad蛋白随时间延长表达减少;这说明TGF-β1可以直接诱导肺EMT的发生，而且这种作用还存在时间依赖性。E-cad在第3小时时间点上出现一个短暂反弹推测可能与TGF-β1促进A549细胞自分泌TGF-β1到达一定水平产生的负反馈作用有关。

　　在很多器官包括肺的纤维化的诱导中，TGF-β1作为“总开关”被连接在一起[6]。单是TGF-β1在幼鼠和成年鼠肺中的定向表达就可以在微乎其微的炎症下诱导出显著的纤维变性反应[7]，而且如前所讨论，TGF-β1激活障碍可以提供明显的保护作用，阻止博莱霉素在转基因小鼠中诱导的纤维化[8]。这一切似乎提示了，正是因为TGF-β1在EMT的诱导中起到主导作用，它具有极强的促进上皮细胞表型丧失的能力，因此在肺纤维化的发生中起了关键作用。

　　目前，大量涉及EMT的研究主要集中在癌转移及肾纤维化上。EMT在肾纤维化形成中起到突出的作用，在这一过程中，上皮细胞失去了细胞-细胞附件、极性和上皮细胞的特异性标记，经历了细胞支架的重塑，而获得间质细胞的表型。本研究用TGF-β1诱导A549细胞发生了EMT，说明肺泡上皮细胞在体外确实可以发生EMT。但究竟是Ⅰ型肺泡上皮细胞(AT1)还是Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT2)，或者AT1和AT2两种肺泡上皮细胞都经历了EMT仍不确定。可能特定程度的损伤使AT1细胞更有可能经历凋亡而AT2细胞优先选择了EMT。在体外实验中，AT2细胞逐渐表达并获得的所有AT1的表型标志，这表明了AT2细胞在体外朝AT1细胞表型(类AT1细胞)转分化[9-10]。目前的实验条件可以做到将已经获得AT1细胞特征的细胞再次诱导恢复到AT2细胞表型[10]，说明了分化的AEC表型表现出来的可塑性远比之前想象的要大得多。这种惊人的表型可塑性表明了，在某些特定条件下AT2向AT1细胞表型转化受抑制时(例如，损伤)，AT2细胞也有能力通过EMT过程转变成成纤维细胞和肌纤维母细胞。

　　在体内肺纤维化过程中，肺泡上皮的EMT很有可能促进了肺内成纤维细胞和/或肌纤维母细胞的产生。有研究表明，在其他器官的纤维化中，EMT促进至少三分之一的成纤维细胞形成。肺纤维化涉及到肺泡上皮-成纤维细胞串扰及相互作用，AECs在体外受到TGF-β1干预后经历了EMT，在体内TGF-β1在上皮损伤和纤维化邻近区域的表达增加。本研究小组关于EMT的早期研究表明TGF-β1主要影响了肺泡上皮细胞的形态学，而对细胞的增殖影响不大[11]。因此，我们有理由认为，体内的AECs向成纤维细胞和活化的成纤维细胞(肌纤维母细胞)的转化明显促进了肺纤维化的形成。

　　总而言之，TGF-β1可以诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化，肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。然而，肺EMT引发的问题和发生过程中的信号通路还需要进一步的研究。通过诱导或促进肺泡上皮细胞向间质细胞转化，可以促使肺纤维化的发病，而通过阻断这一过程及其下游的信号转导通路有可能改善肺损伤后异常修复和纤维化的破坏效应，为治疗肺纤维化提供更好的方法。

　　【参考文献】

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　　[9]Borok Z，Danto SI，Lubman RL，et al.Modulation of t1alpha expression with alveolar epithelial cell phenotype in vitro[J].Am J Physiol，1998，275：L155.

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　　[11]郑金旭,张小燕.转化生长因子-β1诱导A549细胞向间充质细胞转化的作用研究[J].江苏大学学报(医学版),2008,18(4):327.