肺癌侵袭和转移相关因子表达机制的研究

　　作者：石青　　作者单位： 重庆市铜梁县人民医院内一科

　　【摘要】 目的 探讨MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF在肺癌组织中的表达，研究其与肺癌的侵袭和转移的关系。方法 对我院经根治性切除的肺癌，术后得到病理证实患者，进行肺癌侵袭和转移相关因子研究，采用肺癌组织石蜡切片进行免疫组化分析。结果 研究发现69例肺癌组织中MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF蛋白阳性表达总蹬阳性率分别为86.9%、88.4%、57.9%、81.2%、82.6%，其蛋白的阳性表达与临床分期、复发转移、分化程度等密切相关。结论 MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF蛋白表达与肺癌侵袭与转移机制关系密切，并可能成为判断肺癌治疗效果和预后的可靠指标之一。

　　【关键词】 肺癌,侵袭,转移,机制

　　【Abstract】 Objective To observe the expressions of MMP2, MMP9, Fas, HIFlα, VEGF in bronchogenic carcinoma tissue, and to investigate the relationship between these factors and invasion as well as metastasis of bronchogenic carcinoma. Methods 69 patients who were enrolled in our hospital were treated with radical excision and identified as bronchogenic carcinoma by pathology. The expressions of MMP2, MMP9, Fas, HIFlα, VEGF were detected by immunohistochemical method.Results The positive expression rates of MMP2, MMP9, Fas, HIFlα, VEGF in bronchogenic carcinoma tissue were 86.9%, 88.4%, 57.9%, 81.2%, 82.6%, respectively. The expression levels were related with clinical stage, palindromia or metastasis, histological differentiation. Conclusion The expression of MMP2, MMP9, Fas, HIFlα, VEGF in bronchogenic carcinoma tissue is closely related with the invasion and metastasis mechanism of bronchogenic carcinoma, which can serve as one of the indexes for evaluating the therapeutic effect and prognosis in patients with bronchogenic carcinoma.

　　【Key words】 bronchogenic carcinoma; invasion; metastasis; mechanism

　　为了探讨肺癌侵袭、转移的分子机制，寻找预防、早期诊断和治疗肺癌侵袭、转移的有效途径，本文对我院经根治性切除的肺癌，术后得到病理证实患者，进行肺癌侵袭和转移相关因子的研究，报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 选择我院2003年3月至2007年9月经根治性切除的非小细胞肺癌(NSCLC)并有完整资料且术后得到病理证实的肺癌患者69例，对其免疫组织化学蜡块进行研究。其中男42例，女27例;年龄42～75岁，平均年龄63.4岁。鳞状细胞癌24例，腺癌16例，腺鳞癌9例，肺泡癌9例，未分化伴多形细胞癌1例，大细胞癌5例，大小细胞混合癌5例。分化程度：Ⅱ级35例，Ⅲ级34例。全部患者术前未行放化疗或其他免疫治疗。临床分期采用1997年10月国际抗癌联盟(UICC)第5版《恶性肿瘤TNM分类》修订的临床分期标准。Ⅰ期19例，Ⅱ期26例，Ⅲ期24例。有淋巴结转移者39例，无淋巴结转移者30例。手术期间或术后4个月内随访患者发现肺内、外明确的转移灶包括淋巴结转移作为癌转移评价标准。取存档石蜡包埋组织标本，制成4 μm厚的连续切片，进行免疫组化研究。

　　1.2 主要试剂 鼠抗人MMP2单克隆抗体、鼠抗人MMP9单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人Fas多克隆抗体购自福州迈新公司， DAB显色试剂盒和SP法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人多克隆抗体HIF1购自武汉博士德生物技术有限公司。

　　1.3 免疫组化染色 采用MixsionTM通用型。肺癌组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，置于3%过氧化氢液体，以阻断内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤，置于医用微波炉内105℃加热修复抗原，PBS缓冲液洗涤，分别滴加不同抗体(1∶100;MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF)，置湿盒内室温下孵育120 min，PBS缓冲液洗涤，滴加通用型MixsionTM通用型试剂2滴，室温下孵育30 min，PBS缓冲液洗涤，DAB复染(DAB配法：在0.9 ml蒸馏水中加DAB solutionA和DAB solutionB各50 μl)，显微镜下控制染色时间，自来水冲洗，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每次染色均设对照作为染色质量控制标准。阳性对照采用已知阳性肺癌标本的表达抗体组织，空白对照采用PBS液代替一抗。所有对照均与实验标本在相同条件下严格按照试剂盒推荐方法进行。

　　1.4 结果判断标准 胞膜、胞浆内均无反应者为阴性，胞膜或胞浆染成棕色为阳性反应。每张切片高倍镜下任取4个视野，每张切片计数200个细胞，计算各级阳性细胞所占百分率。标准MMP2、MMP9和Fas抗原阳性物质为棕黄色颗粒状。HIF1α主要定位于肿瘤细胞奖或细胞核中，呈棕黄色颗粒状。VEGF主要定位于肿瘤细胞奖中，呈棕黄色颗粒。表达强度标准参照IRS基于3个参数的半定量计数方法[1]，计算阳性细胞所占百分比。0分为阴性(-)，整张切片无着色或无阳性细胞;1分为弱阳性(+)，淡黄色或阳性细胞1%～10%;2～3分为阳性(++)，棕黄色或阳性细胞11%～50%;大于3分为强阳性(+++)，棕褐色或阳性细胞>50%。

　　1.5 统计学分析 MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF抗原的表达与NSCLC临床病理特征的关系用χ2检验。单因素分析用KaplanMeier法描绘曲线并进行生存率估计，曲线比较用Logrank检验，生存分析比较用u检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肺癌组织中MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF蛋白阳性反应为细胞内呈黄色或棕黄色颗粒，本组研究发现69例肺癌组织中MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF蛋白阳性表达总的阳性率分别为86.9%、88.4%、57.9%、81.2%、82.6%，与患者的性别、年龄均无关系(P>0.05)，见表1。表1 MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF抗原的表达比较n=69，

　　2.2 MMP2、MMP9、Fas、HIFlα、VEGF蛋白的阳性表达与临床分期的关系 分期越高，阳性表达越高(P<0.01)，见表2。表2 MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF抗原表达与临床分期、复发转移关系例注：与Ⅰ期比较，P<0.01;与Ⅱ期比较，#P<0.01

　　2.3 阳性表达率复发转移各组间比较 在高中分化肿瘤中的表达要明显高于低分化(P<0.01)，见表3。表3 MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF抗原表达与复发转移的关系例注：与低分比较，P<0.01

　　3 讨论

　　肺癌是一种常见的恶性肿瘤，临床治疗采用以手术为主的综合治疗，但肺癌的影响不仅在于手术治疗，还要考虑远期生存率。肺癌侵袭、转移是一个极其复杂的多基因调控和多步骤发展过程，涉及到肿瘤细胞、机体、靶组织的相互影响和作用，一系列肿瘤侵袭转移相关基因的结构、功能的异常。肺癌患者的机体中某些基因被激活，某些基因受抑制，而另一些基因则表现为缺失或功能失活，或者相互拮抗，从而影响其抗侵袭转移功能的正常发挥，最终导致肿瘤的转移。研究肺癌侵袭机制，预测肺癌的转移潜能，有助于肺癌患者的预后和选择合理有效的治疗方案，延长患者的生存期和提高生活质量。如肺癌细胞核DNA含量、P53、CerbB2、bc12、Ecad表达、血管生成因子等与肺癌CT表现密切相关但与肺癌浸润转移密切相关[2]。基质金属蛋白酶可降解细胞外基质，在肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用。MMP家族中MMP2、MMP9能够分解Ⅳ型胶原蛋白，与过度表达与恶性肿瘤的浸润、转移有关。恶性肿瘤在生长过程中，由于组织增生过快造成局部组织严重缺氧，HIF1在组织处于缺氧状态时它发挥转录和基因调控作用，VEGF能刺激肿瘤细胞的有丝分裂，促进新生血管形成[3]。

　　目前通常认为癌症细胞通过粘附、降解和移动从而完成癌细胞的侵袭转移。细胞外基质和基膜是癌细胞生长和扩散的基础屏障，癌细胞在穿越组织自然屏障向身体远隔部位转移的过程中需要产生或诱导产生蛋白酶类以降解细胞外基质。目前已证实基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外基质中的所有成分，在癌细胞侵袭和转移中起极为重要的作用。

　　对人体不同部位、不同组织类型的肿瘤组织进行的研究表明，MMP2、MMP9在多种肿瘤组织中有不同程度的阳性表达，在肿瘤组织中的表达和活性明显高于周围正常组织或良性病变[4]。本实验中MMP2、MMP9蛋白阳性表达总的阳性率分别达到86.9%和88.4%。Fas抗原是细胞凋亡过程中重要的信号传递分子，具有诱导细胞凋亡的能力。正常情况下由Fas和FasL组成的Fas系统能有效地去除过度激活的免疫活性细胞，在维持机体自身稳定上起着重要作用。有研究表明发现恶性肿瘤与正常组织相比，Fas表达明显下调或丢失，而发生转移的肿瘤近乎完全丢失[5]。这与本研究中研究结果相类似。

　　HIF1α在癌细胞发生缺氧状况下的转录因子，在适应缺氧、能量代谢、肿瘤血管生成、侵袭和转移中起重要作用。恶性肿瘤在生长过程中，由于组织增生过快造成局部组织严重缺氧，此时HIF1α在组织处于缺氧状态时发挥转录和基因调控作用。免疫组化研究发现在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中HIF1α过度表达，在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘HIF1α表达明显增多，而肿瘤组织内的基质细胞和邻近的正常组织则未见表达，这说明HIF1α在促进肿瘤生长方面起着重要作用。本研究发现HIF1α在肺癌组织及坏死的肿瘤组织中过度表达，而对照炎性假瘤表达较少。VEGF能以自分泌及旁分泌形式刺激肿瘤细胞的有丝分裂。同时，它能特异性作用于血管内皮细胞，引起血管内皮细胞分裂增殖和血管构建，从而促进新生血管形成。此外，VEGF能增加血管通透性，是已知最强的血管渗透剂，它通过增加内皮细胞内囊泡的功能发挥渗透作用，形成一个有利于与人分子渗透的通道，这对血管形成前肿瘤营养运输起着重要作用[6]。血管生成因子可促进肿瘤微血管生成，丰富的肿瘤新生血管必然会加速实体瘤的生长、浸润及转移。本研究发现VEGF蛋白表达为82.6%，说明癌细胞的生长与VEGF蛋白表达密不可分，VEGF促进更多血管的生成，从而为癌细胞提供更多养分，使癌细胞快速生长。研究结果表明MMP2、MMP9、Fas、HIF1α、VEGF蛋白表达与肺癌侵袭与转移机制关系密切，并可能成为判断肺癌治疗效果和预后的可靠指标之一。

　　【参考文献】

　　1 Htmaphrey PA，Wong AJ，Vogelstein B，et al.Amplification and expression of EGFR in human glioma xenografts.Cancer Res，1998，48：22312238.

　　2 周清华.肺癌基础研究和临床治疗的分子时代——第十一届世界肺癌大会评述.中国肺癌杂志，2005，8：361.

　　3 周清华，王艳萍主编.肺癌新理论新技术进展——肺癌侵袭和转移的分子机制.第1版.成都：四川大学出版社，2003.90110.

　　4 闫承慧，吴焱，金焰.不同转移能力的肺腺癌细胞系金属蛋白酶活性分析.遗传，2000，22：239.

　　5 高建军，王为忠，王剑波.大肠癌Fas抗原测定与临床生物学意义的相关研究.中华肿瘤杂志，2000，22：314.

　　6 Yuan A, Yu CJ, Chen WJ, et al.Correlation of total VEGF mRNA and protein expression with histologic type，tumor angiogenesis, patient survival and timing of relapse in nonsmallcell lung cancer.Int J Cancer, 2000, 89:475483.