靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞

　　作者：涂明利,徐永健,卢进昌,冯静波　　作者单位：1华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科，湖北 武汉 430030;郧阳医学院附属太和医院2呼吸内科;3生命科学研究所，湖北 十堰 442000

　　【摘要】目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以人脐静脉内皮细胞为靶细胞，设计针对Akt1基因mRNA的siRNA (siAkt1)，利用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞，采用半定量PCR技术(RTPCR)检测Akt1 mRNA的表达，用Western blotting 技术检测Akt总蛋白表达。同时用体外“伤口愈合”实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制内皮细胞Akt1 mRNA(P<0.01)和Akt总蛋白的表达(P<0.05)，A549细胞条件培养基显著促进人脐静脉内皮细胞迁移(P<0.05)，但对转染siAkt1的人脐静脉内皮细胞迁移没有促进作用(P>0.05)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用，这为肺癌血管生成干预治疗提供了新的理论基础。

　　【关键词】 肺癌,RNA干扰,基因,Akt1,内皮细胞,迁移

　　Abstract:Objective To investigate the effect of siRNA on Akt1 gene expression in endothelial cells, and its influence on the migration of endothelial cells induced with lung carcinoma A549 cells conditioned medium(CM).Methods Using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as the target cells,a siRNA sequence targeted Akt1 gene(siAkt1) was designed and transfected into HUVECs mediated with liposome.The expression of Akt1 mRNA was examined with RTPCR,and the Akt protein expression was determined with Western blot.The migration of HUVECs was obsereved with external wound healing experiment.Results HUVECs transfected with siAkt1 could markedly inhibited the expression of Akt1 mRNA (P<0.01)and Akt protein (P<0.05)in endothelial cells,the CM could significantly stimulated the migration of HUVECs(P<0.05).However,CM had no significant effect on the migration of HUVECs transfected with siAkt1(P>0.05).Conclusion Specific siRNA could inhibit the migration of HUVECs induced with A549 cells CM,which may provide a novel strategy for inhibiting tumor angiogenesis.

　　Key words:Lung cancer;siRNA;Gene,Akt1;Endothelial cells;Migration

　　肺癌是当今世界上发病率和死亡率都位于第一的恶性肿瘤，而非小细胞肺癌占80%，其侵袭性生长、转移和预后依赖于血管生成。肿瘤血管生成涉及血管结构的系列病理变化，主要包括血管内皮细胞增殖、存活和迁移，其中血管内皮细胞向肿瘤移行是一个重要环节。Akt(蛋白激酶B/PKB)是PI3KAkt信号传导通路中的重要信号分子，具有多种生物学活性[1]。研究表明抑制Akt活性能诱导细胞的凋亡、抑制细胞的迁移和增殖[2]。体外实验还发现Akt 对于血管的形成有重要作用，Akt能促进血管内皮生长因子诱导的血管内皮细胞迁移[3]。但Akt是否参与了非小细胞肺癌调控的血管内皮细胞增殖、凋亡和迁移，尚未见明确报道，而且对Akt亚型的作用知之甚少。因此，本研究利用非小细胞肺癌条件培养基培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，并用RNA干扰技术特异性抑制Akt1的表达，观察Akt1在肿瘤细胞刺激HUVECs迁移中的作用，为非小细胞肺癌抗血管生成的治疗寻找新的分子靶点。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，OptiMEM(Invitrogen公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(Promega公司)，胎牛血清 (FBS，Gibco公司)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF,Sigma 公司)，兔抗人vWF单克隆抗体(Sigma公司)，TotalAkt多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)，βactin单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，碱性磷酸酶标记的二抗(北京中山公司)。

　　1.2 细胞培养

　　人脐静脉内皮细胞培养：取新鲜的人脐静脉，用0.1%胶原酶和0.125%胰酶的混合液 (1∶4)消化血管内皮细胞，所得的细胞悬液用含20% FBS和终浓度为4 ng/mL的aFGF DMEM/F12培养基置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，约5～7 d长至融合状态。用兔抗人vWF 进行免疫细胞化学检测，vWF阳性着色率达到95%以上，2～4代用于实验。

　　A549细胞培养及条件培养基(conditioned medium,CM)收集：高转移人肺腺癌A549细胞系由本实验室保存，在含有10%FBS的DMEM/F12培养基中培养。待细胞至60%融合时，无血清饥饿24 h后，用5%FBS刺激24 h，无菌收集上清，离心、过滤后，-80 ℃保存备用(A549条件培养基，A549CM)。

　　1.3 siRNA设计、合成、转染

　　以NCBI GenBank提供的人Akt1(No.NM_001014432)mRNA序列为模板，由上海吉玛生物制药公司设计并化学合成Akt1 siRNA(siAkt1)以及Scramble siRNA(siSCR)。序列如下：siAkt1 Sense 5′ggaggguuggcugcacaaatt3′，Antisense 5′uuugugcagccaacccucctt3′; siSCR Sense 5′uucuccgaacgugucacgutt3′，Antisense 5′acgugacacguucggagaatt3′。按照LipofectamineTM 2000说明书进行siRNALipofectamineTM 2000混合物制备，以转染Scramble siRNA(siSCR)组为对照，经过优化实验，最终选用siRNA浓度为40 pmol。

　　1.4 RTPCR检测转染后细胞内Akt1 mRNA水平

　　按照Trizol试剂说明书提取转染后24 h的细胞总RNA，紫外分光光度计定量，逆转录合成cDNA。引物设计如表1。

　　1.5 Western blotting检测转染后细胞内总Akt蛋白水平

　　转染48 h后的内皮细胞，用PBS液洗2次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min后收集各组细胞;紫外分光光度计测定细胞蛋白浓度。10%的SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，电流12～15 mA，蛋白上样量30 μg;半干式电转仪(Biorad 公司)转膜75 min，电压15 V;含5%脱脂奶粉的TBST(TrisBuffered Saline Tween20)室温封闭1 h;加兔抗phosphoAkt和Akt的多克隆抗体 (1∶1 000) 4 ℃于湿盒中反应过夜;二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)室温反应2 h;TBST洗后加NBT/BCIP显色液膜上显色;扫描后使用BIORAD公司一维分析软件Quantity One进行图像灰度分析。

　　1.6 细胞划痕损伤实验

　　实验共分4组：用5%FBS DMEM/F12培养基培养为对照(Control组);实验组用A549细胞条件培养基培养(CM组);细胞转染Scramble siRNA后用A549细胞条件培养基孵育(CM+siSCR组);细胞转染Akt1 siRNA后用A549细胞条件培养基孵育(CM+siAkt1组)。实验前已融合的内皮细胞，5%FBS/DMEM/F12同步化6 h，各组细胞用无菌10 μL的加样枪头在其培养板中划一直线，形成一细胞“裸露”区域，经预热的DMEM/F12洗净刮掉的细胞，分别在孵育0、12 h时40倍倒置显微镜下采集图像，观察各组细胞迁移情况。细胞向划痕损伤后裸露区域爬行(迁移)称为损伤修复(wound closure)，迁移越多则修复越好，“裸露” 间距越短。因此测定各组各时间点细胞“裸露” 区域的间距，即可反映损伤修复和细胞迁移的情况。以control组“裸露”间距的平均值为100%，计算CM组的“裸露”间距相对值(CM组/对照组×100%);以CM+siSCR组“裸露”间距的平均值为100%，计算CM+siAkt1组“裸露” 间距的相对值[(CM+siAkt1)组/(CM+siSCR)组×100%]。

　　1.7 统计学处理

　　每次实验独立重复3次(n=3)，各组实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11.0数据包进行处理，组间差异用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 人脐静脉内皮细胞siRNA转染对Akt1 mRNA表达及Akt蛋白表达的影响由图1可见，RTPCR结果(图1A)显示，Akt1 siRNA转染24 h后细胞Akt1 mRNA表达水平明显下调(与siSCR组相比P<0.01)，且对Akt2 mRNA表达没有影响。Akt1 siRNA转染48 h后，Western blotting结果(图1B)显示，siAkt1组也同时明显抑制了总Akt的表达(与Scr组相比P<0.05)。说明siRNA可高效、特异地抑制目的基因的表达。

　　2.2 A549条件培养基(CM)对人脐静脉内皮细胞迁移的影响

　　6孔培养板中已融合的HUVECs，划痕后换条件培养基，对照组继续用5%FBS，12 h后观察细胞迁移能力变化。结果显示，用A549条件培养基刺激后能明显促进HUVECs迁移(P<0.05)。

　　2.3 Akt1 siRNA转染后A549细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞迁移的影响

　　与细胞转染Scramble siRNA后用A549细胞条件培养基孵育的CM+siSCR组相比，细胞转染Akt1 siRNA后用A549细胞条件培养基孵育的CM+siAkt1组HUVECs迁移显著减弱(P<0.05)，显示Akt1siRNA转染可以显著抑制A549条件培养基诱导的HUVECs迁移。

　　3 讨论

　　非小细胞肺癌早期诊断率低,多数患者确诊后已丧失手术治疗机会,化学治疗和放射治疗的结果一直无突破性进步[4]。因此，寻求新的更有效的治疗手段迫在眉睫。肿瘤的生长与转移依赖于血管生成，因此近些年对肿瘤血管生成机制的探讨，特别是对血管内皮细胞生长有效干预，已成为研究抑制肿瘤的生长和转移的热点[5]。研究表明抗肿瘤血管生成将是治疗宫颈癌的有效新策略[6]。

　　血管生成的步骤包括：基底膜和细胞外基质降解，血管内皮细胞粘附、迁移、增殖，形成管腔结构，最后形成新生血管等。目前认为，癌细胞能分泌大量促进血管生长的许多血管生长因子，使肿瘤形成新的血管而快速生长。其中，血管内皮细胞粘附、迁移是关键。血管内皮细胞迁移受多种生长因子和信号分子的影响。孔霞等[7]报道基质细胞衍生因子1对人脐静脉血管内皮细胞迁移起促进作用。而Akt信号传导通路对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移的调控起重要作用。Akt 磷酸化后激活内皮一氧化氮合酶，导致新生血管形成，促进血管内皮生长因子诱导的内皮细胞迁移[3]。但Akt是否参与了非小细胞肺癌调控的血管内皮细胞增殖、凋亡和迁移，以及Akt的哪一个亚型起主要作用尚不了解。

　　RNA干扰技术具有特异、高效和毒性小的特点，可高效、特异地抑制特定基因的过度表达，且能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，产生类似基因敲除的效应。Akt有Akt1、Akt2、Akt3三个亚型，研究发现内皮细胞Akt1的表达占到总Akt的70%～80%[8]，本实验结果表明特异性针对Akt1的siRNA能够有效的抑制人脐静脉内皮细胞Akt1 mRNA的表达，同时没有影响Akt2 mRNA水平的变化，但对Akt总蛋白的表达产生明显的抑制作用，说明Akt1在上述三个亚型中起主要作用。这为研究Akt1基因在血管内皮细胞的调节作用提供了一个有效可行的方法。

　　本研究利用RNA干扰技术，特异性siRNA抑制Akt1基因的表达后，阻断了A549条件培养基促进人脐静脉内皮细胞迁移的作用，提示肺腺癌可能通过激活Akt1促进血管内皮细胞迁移。这将为非小细胞肺癌抗血管生成的治疗找到一个新的分子靶点。

　　【参考文献】

　　[1]Sugden PH.Ras,Akt and mechanotransduction in the cardiac myocyte[J].Circ Res,2003,93(10):1 179-1 192.

　　[2]Jin CY,Moon Do,Lee JD,et al.Sulforaphane sensitizes tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligandmediated apoptosis through downregulation of ERK and Akt in lung adenocarcinoma A549 cells[J]. Carcinogenesis,2007,28(5):1 058-1 066.

　　[3]Dimmeler S, Zeiher AM.Akt takes center stage in angiogenesis signaling[J].Circ Res,2000,86(1):4-5.

　　[4]明帮春,骆志国,熊 奎.大分割三维适形放射治疗非小细胞肺癌46例[J].郧阳医学院学报,2007,26(3):167-168.

　　[5]Pandya NM, Dhalla NS, Santani DD.Angiogenesis:a new target for future therapy[J].Vascul Pharmacol,2006,44(5):265-274.

　　[6]段迎春,胡 平,范 丽,等.人参皂甙Rg3对荷宫颈癌裸鼠血管生成的抑制作用[J].郧阳医学院学报,2007,26(1):25-27.

　　[7]孔 霞,郭凌郧,陈 龙,等.基质细胞衍生因子1对人脐静脉血管内皮细胞迁移的影响[J].郧阳医学院学报,2007,26(3):129-157.

　　[8]Chen J, Somanath PR, Razorenova O,et al.Akt1 regulates pathological angiogenesis, vascular maturation and permeability in vivo[J].Nat Med,2005,11(11),1 188-1 196.