呼吸衰竭患者外周血T淋巴细胞亚群的相关研究

　　作者：刘建强,席素雅,李秀武,张玲,魏慧玲　　作者单位： 石家庄市，河北省胸科医院

　　【摘要】目的分析呼吸衰竭患者外周血T淋巴细胞亚群的特点、影响因素、临床意义及其治疗前后测定值的变化。方法 采用免疫组织化学染色的方法测定100例呼吸衰竭患者CD3+、CD4+和CD8+细胞的阳性细胞百分率、CD4+ /CD8+比值以及患者治疗前后外周血中T细胞亚群水平，并与正常对照组进行比较分析。结果 呼吸衰竭患者外周血CD3+、CD4+明显减少,而CD8+明显增加,CD4+ /CD8+比值明显下降,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)。呼吸衰竭治疗后CD3+、CD4+细胞、CD4+ /CD8+比值较前升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 呼吸衰竭患者存在细胞免疫功能紊乱,检测患者外周血T淋巴细胞亚群表达对评估患者的细胞免疫功能及疾病的诊断具有重要的临床意义。

　　【关键词】 呼吸衰竭,碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶,CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+

　　淋巴细胞是机体最主要的免疫细胞群，是反映机体细胞免疫功能状态的一个重要指标。正常机体内T淋巴细胞亚群之间相互作用维持着机体的正常免疫功能[1]，当细胞亚群在数量上和(或)功能上发生改变时,就可能导致机体免疫功能紊乱而出现疾病。近年来，关于恶性肿瘤、肺结核、慢性阻塞性肺病、糖尿病等患者外周血T淋巴细胞变化特点的研究较多，但呼吸衰竭患者T淋巴细胞亚群的特点及其治疗前后的变化少有报道。为此,本研究采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)桥联酶标免疫法分析呼吸衰竭患者T淋巴细胞亚群的特点以及治疗前后的变化，探讨在呼吸衰竭的发生、发展及治疗过程中，T淋巴细胞亚群的变化及临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选择我院2005年1月至2008年12月收治入院的患者100例为病例组，其中男55例，平均年龄57岁;女45例，平均年龄54岁。慢性阻塞性肺病30例，肺结核42例，间质纤维化12例，肺癌16例。所有病例均经病理或胸部CT确诊，经动脉血气分析示Ⅰ型或Ⅱ型呼吸衰竭，诊断标准依照《中华医学会呼吸学分会制定的诊断标准》。正常对照组：于我院体检中心进行体检的健康者100例，其中男59例，女41例。全部病例于确诊后抽取外周血检测T淋巴细胞亚群水平。

　　1.2 检测方法与试剂

　　采用APAAP桥联酶标免疫法[2]检测患者T淋巴细胞亚群，试剂盒购自北京博海生物科技公司。(1)单个核细胞涂片制备：取正常对照组和患者在治疗前和治疗后的肝素抗凝静脉血1～2 ml，用PBS缓冲液稀释2～3倍，加入到含有2～3 ml淋巴细胞分离液的试管上层，血液要沿管壁缓缓加入，使两液间保持清晰界面。2 000 r/min离心15～20 min，吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层，加5倍PBS缓冲液混匀，800～1 000 r/min 离心5 min，去掉上清，沉淀即为单个核细胞。将上述分离好的细胞混匀获得悬液，取细胞悬液涂于玻片上(玻片预先做防脱片处理)，涂一薄层细胞，快速吹干。(2)标本染色：①固定1～2 min后，用PBS冲洗;②加单克隆抗体10～15 μl，放湿盒20～30 min; ③加羊抗鼠IgG二抗10～15 μl，温室放置20～30 min; ④加APAAP复合物10～15 μl，温室放置20～30 min;⑤加碱性磷酸酶底物显色(临用前取底物，按每毫升底物液加1 mg坚固红充分混匀，取20～40 μl加于标本上，温室显色15～30 min); ⑥用自来水中止显色;⑦加苏木素复染液一滴复染1～2 min，用自来水冲洗干净。(3)结果观察：高倍镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞，无红色标记物的细胞为阴性细胞，计数100～200个单个核细胞，计数阳性细胞百分率，进行比值计算。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 呼吸衰竭患者外周血T淋巴细胞亚群与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 呼吸衰竭患者外周血T淋巴细胞亚群与正常对照组比较(略)

　　2.2 呼吸衰竭治疗后下细胞亚群较治疗前后均有显著变化(P<0.05或<0.01)。见表2。表2 呼吸衰竭患者治疗前后T细胞亚群的变化特点(略)注：与正常对照组比较，*P<0.01; 与治疗前比较，#P<0.05，△P<0.01

　　3 讨论

　　人体有一个完善的免疫系统,主要肩负着免疫防护、免疫稳定以及免疫监视的作用, 对入侵的外源性抗原物质如细菌、病毒和体内出现的异常细胞如肿瘤细胞、胞内微生物感染细胞等,能及时产生免疫应答予以杀灭,不致于造成机体的损伤。但当其结构或功能有缺陷或失调时,就会引起严重的危害人体的传染病、肿瘤以及自身免疫病等疾患。近年来，多项研究发现，恶性肿瘤、糖尿病、结核、慢性阻塞性肺病以及慢性支气管炎急性发作等患者[3-7]较健康人群免疫力低下，通过给予免疫调节剂来纠正机体的免疫失衡状态在很大程度上可以缓解病情，缩短疗程，改善预后。

　　本研究通过对多种病因造成的呼吸衰竭患者进行临床分析，探讨呼吸衰竭患者T细胞亚群的特点及其治疗前后的变化，为呼吸衰竭患者的临床治疗提供新的治疗途径及理论依据。研究结果显示，呼吸衰竭患者外周血CD3+和CD4+细胞数量明显减少，CD8+细胞数目增高，CD4+ /CD8+比值下降，与正常对照组比较差异显著( P<0.01)，提示呼吸衰竭患者外周血T细胞总数及辅助性T淋巴细胞降低，而抑制性T淋巴细胞增多，这些免疫抑制导致呼吸衰竭患者自体细胞免疫调节网络呈现抑制性优势而出现不同程度的继发免疫缺陷，以至免疫系统不能有效地识别和杀伤细胞而使疾病得以发生和发展。

　　另外，呼吸衰竭患者治疗后2周复测T细胞亚群水平，显示CD3+ 和CD4+细胞数明显增多,CD4+ /CD8+比值升高，提示呼吸衰竭患者通过抗感染，纠正呼吸衰竭，改善营养状况，可以部分清除免疫抑制，使免疫功能在不同程度上得以恢复。

　　T淋巴细胞亚群是机体免疫系统内最重要的细胞亚群，主要由CD4+(辅助/诱导T细胞)和CD8+(抑制/杀伤T细胞)组成，二者之间相互协调，稳定地调节着机体的免疫应答反应[8,9]。CD4+ 细胞和CD8+细胞是T淋巴细胞中功能相异的两个亚群，在机体免疫应答中分别起辅助、诱导和抑制、细胞毒作用，发挥正、负调节作用，形成T细胞网络。它们通过细胞间的直接接触或通过释放细胞因子，导致或抑制效应，使免疫应答在双向调控下表现出适当的强度。机体的相对免疫平衡状态主要由二者之间相互影响来维持，两亚群细胞比例失调就会产生免疫功能失常，因此CD4+/CD8+比值代表了整体的免疫平衡，比值的降低可能反映了机体易感性一时性的增加，其正常比值在1.5～2.0[10]。

　　呼吸衰竭患者可能存在明显的细胞免疫异常,其辅助性CD4+ T细胞减少，抑制性CD8+ T细胞增加。可能是通过以下机制导致疾病的产生：(1)CD4+ T细胞减少，导致依赖T淋巴细胞的B细胞增生、分化成浆细胞的能力下降,从而不能分泌出更多的抗体(免疫球蛋白)，使机体对细胞内寄生的细菌或病毒杀伤能力降低,导致抗感染免疫能力下降;(2)CD8+ T细胞增加，导致具有免疫功能的其他T淋巴细胞减少或活性降低，抑制了T淋巴细胞和疾病作斗争，使机体对抗原处理能力下降，并可能造成部分器官损伤。CD3+ 、CD4+细胞和CD4+ /CD8+比值下降,可能是患者血清中含有抑制机体免疫功能的成分,这些免疫抑制成分作用于淋巴细胞亚群，影响了宿主的免疫防御,使患者免疫调节功能发生紊乱。本文提示呼吸衰竭患者免疫功能紊乱，其识别和杀伤外来细菌、病毒的能力下降,机体处于免疫抑制状态。患者入院后通过给予多种抗生素控制感染，纠正低氧血症，改善通气，促进二氧化碳排出，纠正酸碱失衡及电解质紊乱等综合治疗，在缓解期复测CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均较治疗前显著升高，表明病情与细胞免疫功能变化是一致的。

　　机体免疫功能异常是导致病情加重和预后不良的主要原因之一。只有在治疗原发病的基础上，同时积极纠正和改善机体细胞免疫状况，才能增强机体的免疫功能，以缓解病情、提高疗效和改善预后。临床上检测呼吸衰竭患者外周血T淋巴细胞亚群的水平及治疗前后的变化,对于合理选择治疗方案、判断病情进展、评估预后、监测复发具有重要的临床意义。

　　【参考文献】

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　　10矫伟主编.剧烈运动对机体免疫功能的影响以及检测与调节方法的研究. 第1版.北京:北京体育大学出版社，2003.9091.