脑星形细胞瘤中PTEN表达和微血管密度相关性研究

　　作者：刘国敏,杨颖,卜志平,杨兰,王晓鹏　　作者单位：050000 石家庄市，河北医科大学第二医院神经内科(刘国敏、卜志平、杨兰、王晓鹏);河北省保定市第一中心医院消化内科(杨颖)

　　【摘要】目的 探讨人脑星形胶质细胞瘤中PTEN表达与微血管密度(microvessel density，MVD)之间的关系及意义。方法 60例人脑星形胶质瘤标本和8例正常脑组织采用免疫组织化学ABC方法检测PTEN表达和MVD。结果 在正常脑组织及各级别的星形细胞瘤中均有CD34表达，表达强度不等。高级别胶质的MVD与低级别胶质瘤MVD之间、低级别胶质瘤与正常脑组织之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 PTEN蛋白存在于人脑胶质瘤细胞中，PTEN的表达与MVD的测定可作为判断脑星形细胞瘤恶性潜能的重要生物学指标，对判断人脑胶质瘤的临床病理分级具有重要价值。

　　【关键词】 星形细胞瘤 肿瘤血管形成 PTEN基因 免疫组织化学

　　Correlation between the expression of PTEN and microvessel density in human astrocytomas 　　LIU Guomin， YANG Ying, BU Zhiping, et al.　　The First Hospital of Hebei Medicine University, Shijiazhuang 062150, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between PTEN and microvessel density(MVD),and to explore its significance in human astrocytomas.Methods The expression of PTEN and microvessel density were measured in 60 astrocytomas samples and 8 normal brain tissue samples by immunohistochemical ABC method. Results CD34 monoclonal antibody was expressed in normal brain tissues and different grade astrocytomas, and significant difference was found between low grade and high grade astrocytomas(P<0.01). Conclusion PTEN protein exists in human astrocytomas. PTEN and MVD are important biological markers, which can judge malignant potency, and which are important for clinical pathological classification of glioma.

　　【Key words】 astrocytoma; neovascularization; PTEN gene; immunohistochemistry

　　PTEN 基因是一种抑癌基因，其编码蛋白的N端具有与细胞张力蛋白和辅助蛋白同源的序列，参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞浸润、血管发生及肿瘤转移中起一定作用[1]。有关PTEN基因的研究多集中于基因水平，对该基因的产物PTEN蛋白在细胞内定位及在肿瘤中的表达情况报道甚少。本实验通过检测脑星形细胞瘤中微血管密度(microvessel density,MVD)及PTEN基因的表达，探讨PTEN表达对星形细胞瘤血管形成的影响，为寻求脑胶质瘤的新型治疗模式提供理论基础和依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 收集河北医科大学第二医院神经外科2001年1月至2002年12月手术切除、临床资料完整的人脑星形细胞瘤标本60例。其中男36例，女24例;年龄18～67岁，平均年龄38.5岁。对照组8例，正常脑组织是由脑外伤内减压手术获得。患者术前均未经放化疗，按1999年WHO脑肿瘤分类，本组中星形细胞瘤Ⅰ级10例，Ⅱ级12例，Ⅲ级15例，Ⅳ级23例。术后标本置入4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片4张，1张作为常规HE染色，用于重新确定病理结果，余做免疫组织化学染色。

　　1.2 仪器 WG2003台式干燥箱(重庆四达实验仪器有限公司);Leica RM2125切片机(上海徕卡仪器有限公司);SHAC恒温振荡器(北京医疗设备厂)。

　　1.3 抗体和试剂 一抗为小鼠抗人PTEN单克隆抗体，二抗为鼠抗人原始造血细胞单克隆抗体(CD34)，以上抗体均为即用型。正常山羊血清封闭液，生物素化山羊抗小鼠IgG和DAB显色剂均购于北京中山生物技术有限公司。

　　1.4 方法 免疫组化SABC法染色：常规脱蜡至水，蒸馏水新鲜配置3%H2O2，灭活内源性酶。热抗原修复后加抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原。滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min后弃多余液体，不洗。滴加一抗(即用型)，4℃过夜，滴加二抗，滴加SABC，PBS冲洗，5 min连续3次，DABH2O2显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，每一抗体分别设立阳性和阴性对照，已知阳性片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

　　1.5 结果判断 PTEN阳性表达表现为瘤细胞胞浆呈棕黄色着色：(1)高倍镜(×400)下在每一切片角和中央取5个高倍视野，各计算100个瘤细胞中PTEN阳性细胞数，PTEN的阳性表达率小于20%为阴性，大于20%为阳性。(2)MVD计数按照Weidner[2]的方法加以改进，先在低倍视野下寻找血管密集区，然后在高倍视野下计数微血管数目，分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果，单个的棕黄色内皮细胞或细胞簇做一个血管计数，但是肌层较厚及管腔大于8个红细胞直径的血管不计数，计5个视野的MVD，取其平均值作为IMVD。全部切片的MVD计数均在未知其它相关资料的情况下进行。

　　1.6 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析;多组间两两比较采用Newmankeuls检验;PTEN表达与病理学分级行Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MVD的测定 CD34染色仅见于血管内皮细胞，胞浆呈棕黄色染色。在正常脑组织及各级别的星形细胞瘤中均有CD34表达，表达强度不等。正常脑组织MVD为(14±4)/HP，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级星形细胞瘤中MVD分别为(17±6)/HP,(20±6)/HP,(28±7)/HP和(30±7)/HP。高级别胶质瘤的MVD与低级别胶质瘤MVD之间、低级别胶质瘤与正常脑组织之间差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 PTEN在星形细胞瘤中的表达 免疫组织化学染色显示PTEN蛋白主要分布在正常脑组织细胞和低级别的星形细胞瘤的瘤细胞中，呈高水平表达。而高级别的星形细胞瘤的瘤细胞中，呈低水平表达。PTEN在正常脑组织中的阳性表达率为100%，在人脑低级(Ⅰ、Ⅱ级)别胶质瘤中的阳性表达率为77.3%，高级别(Ⅲ、Ⅳ级)为31.6%。PTEN的阳性表达率随着肿瘤分级的不同呈下降趋势，即Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅲ级>Ⅳ级。Spearman等级相关分析显示，PTEN表达与病理组织学分级呈显著性负相关(r=-0.401，P<0.01)。

　　2.3 PTEN表达状态与MVD的关系 PTEN表达阳性组与阴性组的MVD分别为(21±7)/HP和(30±6)/HP，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨论

　　肿瘤的生长和转移有赖于肿瘤的新生血管，肿瘤血管生成的调节涉及到肿瘤实质、间质、血管内皮细胞，纤维母细胞与细胞外基质之间的复杂机制，并受到促血管生成与抗血管生成因子的双重调节。瘤实体在形成血管之前，肿瘤细胞处于乏氧状态，这可以诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达及促进血管的生成[3]。肿瘤血管生成以后，血管内皮细胞、巨噬细胞及宿主的良性细胞产生的生长因子通过新生血管抵达肿瘤，导致肿瘤迅速增长，Hanahan等[3]提出开关平衡假说(the balance hypothesis for the angiogenic switch)，认为生长因子的浓度增高和抑制因子的降低会使“开关"处于开启状态，从而导致血管生成。

　　Holash等[4]对鼠Co神经胶质瘤研究发现:首先形成宿主血管无论在管径抑或异质性上，均与正常血管相似，其后将不立即形成血管以维持肿瘤生成，而是退化导致肿瘤细胞坏死，继而在肿瘤边缘有新生血管生成，残瘤将继续增长。新生血管的形成是脑肿瘤生长的必需条件，当肿瘤生长至一定体积时，如无新生血管生成而致肿瘤组织发生退化或坏死[5]。一旦有新生血管长入肿瘤则肿瘤生长迅速。肿瘤新生血管床并非肿瘤自身产生，而是由宿主产生，血管的形成是在肿瘤细胞分泌的多种内皮生长因子作用下产生的。肿瘤的生长分无血管长入的血管前期和血管期，前期肿瘤生长缓慢，肿瘤细胞数少，随着新生血管的逐渐增多而进入血管期，肿瘤生长迅速，肿瘤生长具有侵袭性，肿瘤细胞沿血管开启的组织间隙浸润，侵及周围组织。胶质瘤如伴随有大量微血管形成而成为恶性胶质瘤显著特征。

　　许多学者都研究了人脑胶质瘤标本和细胞系中PTEN基因突变，PTEN基因突变可以发生在任意一个外显子上，并且是PTEN基因功能丧失的主要方式，提示PTEN基因与星形细胞瘤恶性进展密切相关。由于大多数PTEN基因缺失和点突变发生于Ⅳ级星形细胞瘤，明显高于Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级，揭示PTEN基因突变属于较晚期发生的分子事件。Tamura等[6]将胶质母细胞瘤分为原发性和继发性(从Ⅱ级、Ⅲ级演变为Ⅳ级)，原发性胶质母细胞瘤PTEN突变率为32%，而继发性胶质母细胞中为4%，并且此突变在其尚未演化为Ⅳ级时的间变型(Ⅲ级)星形细胞瘤中已存在，这说明原发性、继发性胶质母细胞瘤的基因水平各异。PTEN基因突变主要存在于组织恶性程度高的胶质瘤中，而在组织恶性低的胶质瘤中极少存在，从而推测PTEN基因突变与由低度恶性向高度恶性过渡有关[7]。

　　应用免疫荧光显微镜观察发现，PTEN蛋白定位于胞浆中[8，9]。研究表明：PTEN蛋白具有双重特异性磷酸酶活性，并具有底物的高度特异性，体外底物的酸性特征对其识别具有决定性作用[10]。由于细胞内蛋白质磷酸化水平受蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)和蛋白质酪氨酸酯酶(PTK)的调节，PTP在信号传导、细胞周期进程、细胞间转化中具有双向调节作用，据此推测PTEN作为抑癌基因，在抑制肿瘤生长中具有一定作用[6，11，12]。而张力蛋白和肌动蛋白丝的结合，促其与细胞黏附相连，辅助蛋白则与突触小泡运输功能有关。同时PTP对细胞之间、细胞与细胞外基质之间也具有重要意义，因此PTEN蛋白可能影响瘤细胞浸润和转移过程。

　　PTEN作为目前倍受关注的一种抑癌基因家族新成员，它参与了肿瘤多种生物学行为，PTEN基因是人类肿瘤发生中最常见的基因之一，各家对其突变率报道不一。Duerr等[11]在331例胶质瘤中用SSCP和直接测序法均可检测到PTEN的LOH。Chiariello等[12]研究341例原发性胶质母细胞瘤和21个培养的胶质瘤细胞系中PTEN的编码序列，结果发现59%标本中存在10q23的LOH，17%的原发性肿瘤和一个细胞系存在PTEN突变。研究显示：PTEN/MMAC1/Tep1蛋白表达与肿瘤的组织学分化密切相关，即组织学分化程度高，恶性度低，PTEN/MMAC1/Tep1蛋白表达率越高;不表达或表达弱，多见于组织学分化程度低，恶性程度高的脑胶质瘤[10]。因此，该基因的失活随着肿瘤分化程度的降低而逐渐增加。其突变位点多以第5和第8外显子突变率较高，且多集中于成年患者，并集中于高分化胶质母细胞瘤。在星形细胞瘤中基因点突变和基因缺失均是PTEN基因丧失功能的主要形式。PTEN基因失活与星形细胞瘤恶性进展密切相关，由于大多数PTEN基因缺失和基因点突变发生于Ⅳ级星形胶质瘤，明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，因此PTEN 基因突变或缺失在人脑胶质瘤的发生发展中起重要作用。

　　Rasheed等[13]对不同年龄组和各级别脑胶质瘤123例进行检测，发现42例成人多形性胶质母细胞瘤(GBM)中13例存在PTEN突变，10q23LOH发生率为82%，其中39%的LOH患者同时发生了PTEN突变，纯合性丢失率为25%，研究还发现21例Ⅰ级成人胶质瘤和22例各级儿童胶质瘤中未发生PTEN基因突变，因此PTEN突变的高发生率可能与年龄和胶质瘤恶性度有关，年龄和组织学分级可能是判断患者存活的最佳预测因素。有学者对63例多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者检测发现有27%PTEN基因序列发生突变，其中14例发生LOH，发生率为70%，5%原发PTEN等位基因缺失，该报道与前者存在差异，其可能的原因是在DNA的制备过程中，脑肿瘤组织混有过多的正常组织成份。

　　本研究结果显示人脑胶质瘤中PTEN蛋白表达总阳性率为48.3%，Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级的肿瘤之间存在明显差异(P<0.01)，PTEN阳性表达率与瘤组织病理学分级呈显著负相关(r=-0.401，P<0.05)。我们认为:利用PTEN蛋白单抗检测星形细胞瘤中PTEN的表达对病理学诊断及预后判断等有一定参考价值。PTEN基因突变或缺失在胶质瘤发生发展中起重要作用且与肿瘤恶性分化程度有关。鉴于新生血管形成已成为胶质瘤分级判断之一，明显不同于颅外其它肿瘤，无疑将新生血管形成在脑肿瘤中的作用提高到新的高度。有研究表明：作为PTEN基因的主要调节底物，十四烷酸化PI3K (MyrP3K)和Akt(MyrAkt)的增加可以诱导鸡胚胎绒毛血管生成。Zhong等[14]在前列腺细胞癌细胞株的研究中证实PTEN及其调节的PI3K/Akt信号途径均可阻断HIF1基因转录，直接抑制VEGF的合成，从而抑制血管形成，PTEN还可以影响VEGF、KPR受体的功能。本研究结果显示：星形细胞瘤中PTEN蛋白表达与MVD呈显著负相关，低级别胶质瘤PTEN蛋白表达率高而MVC小。提示：星形胶质瘤中PTEN基因缺失，可能抑制肿瘤血管形成，而PTEN基因异常改变则可能促进肿瘤血管形成，有助于星形细胞瘤的恶性演变。PTEN和MVD都是潜在的星形细胞瘤表型标志物，联合检测上述指标可作为星形细胞瘤病理分级诊断的重要参考依据，也有助于提高评估术后患者生存的准确性。检测PTEN表达状态，深入研究星形细胞瘤新生血管形成机制和揭示其分子生物学基础，将有利于抗肿瘤药物的研发，对于改善胶质瘤的预后也将大有裨益。

　　【参考文献】

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