可卡因苯丙胺调节转录肽对缺血性脑损伤及其神经元半胱天冬氨酸蛋白酶活性的影响

　　作者：陈雪梅,贾佳,徐运　　作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院神经内科 (陈雪梅，徐运);南京大学医药生物技术国家重点实验室(贾佳)

 　　【摘要】目的 探讨可卡因苯丙胺调节转录(CART)肽对缺血性脑损伤及其半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活性的影响。方法 将12只小鼠随机分为CART组与对照组， CART组小鼠侧脑室注射CART多肽，对照组注射生理盐水，然后制作脑缺血模型，2,3,5 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测量梗死体积。体外培养小鼠皮质神经元，制作缺糖缺氧神经元模型，加入 CART多肽或生理盐水，用噻唑蓝染色测细胞生存率，酶联法检测Caspase3活性。结果 CART组脑梗死体积[(0.225±0.044)mm3]显著小于对照组[(0.389±0.055)mm3](P<0.05);CART组神经元生存率(0.494±0.056)显著高于对照组(0.348±0.174)(P<0.05);CART组神经元Caspase3活性(45674±9780)显著低于对照组(51172±2776)(P<0.01)。结论 CART多肽可明显减少缺血性脑梗死体积，提高缺氧神经元的生存率，并降低缺氧神经元的Caspase3活性。

　　【关键词】 可卡因 苯丙胺调节转录肽 脑缺血 半胱天冬氨酸蛋白酶 3

　　Effects of Cocain and amphetamineregulated transcript peptides on ischemic brain damage and Caspase3 activity of neurons

　　CHEN Xuemei, JIA Jia, XU Yun.

　　Department of Neurology, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China

　　Abstract：Objective To investigate effects of Cocain and amphetamineregulated transcript (CART) peptides on cerebral ischemic damage and Caspases3 activities of neurons.Methods 12 mice were randomly divided into CART group and the control group. Mice model of cerebral ischemic was made, after CART group was lateral ventricle injected CART peptides, control group was lateral ventricle injected saline water. Infarction volume was detected by TTC staining. Viability rate of OGDneurons with CART peptides or salinewater, after mice cortical neuron in vitro was detected by MTT. Caspases3 activitie was measured by ELISA.Results Infarction volume in the CART group [(0.225±0.044)mm3] was significantly smaller than that in the control group [(0.389±0.055)mm3](P<0.05). Viability rate of OGDneurons in the CART group(0.494±0.056)was significantly higher than that in the control group (0.348±0.174， P<0.05). Caspase3 activitie of OGDneurons with CART peptides (45674±978) was lower significantly than that with control group (51172±2776)(P<0.05).Conclusion CART peptides can significantly reduce infarction volume of ischemic cerebral infarction, enhance viability of OGDneurons and suppress Caspases3 activities in OGDneurons.

　　Key words：Cocain and amphetamineregulated transcript peptides;cerebral ischemic;Caspase3

　　我们前期的研究[1]发现，在脑缺血时，雌激素可明显增加缺血性大脑皮质的可卡因苯丙胺调节转录(CART)肽mRNA和蛋白的表达水平。但CART多肽是否具有脑和神经保护作用及其分子机制的研究报道很少。为此，本研究观察了CART多肽对大鼠缺血性脑损伤及缺氧神经元半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3活性的影响。现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 清洁型昆明小鼠12只，质量20～25 g,雌雄各半，南京大学医学院附属鼓楼医院动物中心提供。随机分为CART组与对照组，每组6只。怀孕16～17 d昆明小鼠6只用于原代神经元培养。

　　1.1.2 试剂和仪器 Caspase3 荧光测定试剂盒(R&D Systems公司);2,3,5 氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司);神经元培养液和 B27(GIBCO);CART(55102)购于Phoenix pharmaceuticals公司;超速离心机(Beckman Coulfer, Avanti J25);CO2培养箱。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠局灶缺血再灌注模型制作及处理 将小鼠用4%氟烷吸入麻醉，在立体定位仪下，将0.5 μg CART多肽注入CART组小鼠侧脑室(ICV)，对照组小鼠侧脑室注射等量生理盐水。随后立即颈部正中切开，分离大脑中动脉，插入60线栓塞大脑中脑动脉(MCAO)，2 h后拔除线栓，造成一侧大脑中动脉缺血再灌注。

　　1.2.2 梗死体积测定 小鼠缺血再灌注6 h，麻醉后断头取脑，将脑组织在视交叉前后等分间隔2 mm连续作6个冠状切片，将其放入37℃ 2% TTC溶液中30 min，将脑片平置于刻度纸上，正常脑组织为红色，梗死脑组织为白色，数码相机拍照后用Photoshop软件计算每片梗死面积;然后按公式V=Sd/T (S为每一脑片梗死灶面积，d为脑片厚度，T为线形放大倍数)， 计算脑梗死体积。

　　1.2.3 原代神经元培养 取怀孕16～17 d野生型小鼠的胚胎18～25只，分离大脑皮质，1×胰酶消化，置多聚赖氨酸处理的培养皿中，细胞数4×108/ml，每2～3 d部分换液, 培养10～14 d。Neurobasal培养液，加B27和25 μmol/L谷氨酰胺, 37℃，5% CO2培养。分别加入0.4 nmol/L CART多肽及不加任何处理(正常对照组)。

　　1.2.4 缺糖缺氧(OGD)神经元模型制作及处理 原代神经元培养10 d时，换OGD培养基 (120 mmol/L NaCl, 25 mmol/L TrisHCl，pH=7.4, 5.4 mmol/L KCl, 1.8 mmol/L CaCl2)，放进缺氧罩内(充入5% CO2+95% N2，13.98 kPa) 15 min后关阀门， 37°C 2 h，换回正常培养基在5%CO2培养箱中，37°C过夜。5×105的神经元于96孔板内10 d，分别加入生理盐水(对照组)及加入CART多肽0.2 nmol/L、0.4 nmol/L和0.8 nmol/L(小、中、大剂量)。每一浓度设6个平行孔，重复3次。培养12 h。

　　1.2.5 神经元生存率检测 各组培养的神经元加入新鲜配置噻唑蓝(MTT) 0.5 mg/ml， 37℃ 3 h，再加入100 μl二甲基亚枫(DMSO), 10 min,并用微量振荡器振荡使结晶溶解完全,用酶标仪在570 nm测OD值 。

　　1.2.6 神经元Caspase 3活性测定 将原代神经元和OGD神经元用超声破碎，离心收集蛋白样品，按试剂盒说明书步骤操作。实验重复3次。

　　1.2.7 统计学方法 实验数据用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用成组t检验。采用SPSS 11.0统计软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 CART组与对照组脑梗死体积比较 CART多肽组脑梗死体积[(0.225±0.044)mm3]明显小于对照组[(0.389±0.055)mm3] (P<0.05)。见图1。

　　图1 A：CART组，B：对照组;CART组脑梗死体积(白色部分)比对照组明显减小(TTC染色)(略)

　　2.2 CART组与OGD组及正常对照组神经元生存率比较 见表1。OGD组神经元生存率显著低于正常对照组(P<0.01);中剂量CART组、大剂量CART组神经元生存率显著高于OGD组(均P<0.05)，中剂量CART组与大剂量CART组之间神经元生存率差异无统计学意义。

　　表1 各组神经元生存率比较(略)

　　注：OGD组与正常对照组比较▲P<0.01;与OGD组比较*P<0.05

　　2.3 CART组与对照组及OGD神经元与正常神经元Caspase3活性比较 见表2。CART组OGD神经元的Caspase3活性明显低于对照组(P<0.05)，OGD神经元明显高于正常神经元(均P<0.01)。

　　表2 CART组与对照组OGD神经元与正常神经元Caspase3活性比较(略)

　　注：与正常神经元相比▲ P<0.01;与对照组相比*P<0.01

　　3 讨论

　　CART多肽是上世纪90年代发现的一种分泌型神经肽，与摄食行为有关[2]。1996年Douglass[3] 发现大鼠受到精神、运动性刺激后，纹状体CART多肽在转录水平上上调，且人与鼠的CART多肽基因同源性达80%。正常情况下，CART多肽主要分布于下丘脑、垂体、肾上腺、胰腺及消化道。目前已知大鼠脑垂体、肠道、肾上腺内至少有6 种不同的CART 肽(4～14 kD) ,包括大相对分子质量的prepro CART、pro CART 和小相对分子质量具有生理活性的CART 55102和62102。CART多肽在大鼠脑内分布较多,如伏隔核(NAc)、中脑腹侧被盖区(VTA)和杏仁核等与药物诱导奖赏及强化效应有关的脑区,以及与感觉、知觉传递有关的脑区如嗅球、视网膜、丘脑核、脊髓背侧角等部位。在动物肠道内也发现有CART多肽分布,提示CART多肽也是一种纯化的脑肠肽,在肠道及中枢神经系统均起作用[4]。CART多肽具有许多重要的生理功能,包括参与摄食行为、能量调节、药物成瘾及戒除、神经内分泌调节、应激反应、神经营养等功能，在神经和心血管系统中也有调控作用[5-12]。有关CART多肽的研究报道主要在内分泌领域，而CART多肽在缺血性脑损害中的神经保护作用的研究尚未见报道。

　　本研究发现：小鼠侧脑室内注射CART多肽可明显缩小缺血性脑梗死体积。神经元体外实验结果显示：CART多肽明显减少OGD神经元死亡率，提高神经元的生存率，呈剂量依赖性，同时OGD神经元的Caspase3活性增高，加入CART多肽可降低其活性。本研究结果提示，CART多肽对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用，其分子机制可能与抑制Caspase3活性有关。Wu等[13]报道，CART多肽可提高海马神经元的生存率，并增强脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA和蛋白的表达。有关CART多肽神经保护作用的机制可能与增强细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化，激活ERK1和ERK2，影响Ca2+通道有关[1，14，15];也可能是与促进某些神经营养因子释放或干扰Caspase途径，抑制神经细胞凋亡有关。其确切的机制还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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