甲基汞对人类小细胞肺癌NCIH446细胞周期的影响

　　作者：丁会 左孟华 李丹 李志超 作者单位：吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 研究氯化甲基汞(MMC)对小细胞肺癌NCIH446细胞周期的影响。方法 采用流式细胞仪检测了MMC对NCIH446细胞细胞周期的作用，并与目前最常用的化疗药顺铂(DDP)和同样具有剧毒的三氧化二砷(As2O3)做比较。结果 MMC、DDP能使NCIH446细胞表现为G0/G1期细胞数剂量依赖性明显增加，S期细胞数呈剂量依赖性明显减少;As2O3组细胞表现为明显的G2/M期剂量依赖性增加，S期细胞数剂量依赖性减少。结论 MMC、As2O3、DDP均能诱导小细胞肺癌细胞株的细胞周期阻滞，但阻滞作用发生在细胞周期的不同时相。

　　【关键词】 甲基汞;小细胞肺癌;NCIH446细胞;细胞周期

　　The effect of methylmercury on human small cell lung cancer NCIH446 cell cycle

　　DING Hui, ZUO MengHua, LI Dan, et al.

　　Department of Respiration, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the influence of methylmercury (MMC) induced cell cycle stasis in human small cell lung cancer NCIH446. Methods Flow cytometry FCM was used to examine the effects of MMC on the cell cycle of NCIH446 cells and to compare with the current most commonly used chemotherapy drug cisplatin DDP and the samely highly toxic arsenic trioxide As2O3. Results MMC, DDP significantly increased G0/G1 phase cells with dosedependent, significantly decreased S phase cells with dosedependent; As2O3 group cells showed obvious G2/M phase increase and S reduction with dosedependent. Conclusions MMC, As2O3, DDP all can induce cell cycle stasis in different phases of human small cell lung cancer NCIH446.

　　【Key words】 Methylmercury; Small cell lung cancer; NCIH446 cells; Cell cycle

　　小细胞肺癌(SCLC)具有肿瘤细胞倍增时间短，早期即发生血行转移的特点，其中脑转移的治疗是临床关注的问题之一。化疗药物包括应用最广泛的、疗效相对理想的顺铂，均不易透过血脑屏障，不能控制脑转移。氯化甲基汞(MMC)是神经毒性物质，易于透过血脑屏障。研究发现MMC有干扰神经〔1〕及生殖细胞〔2〕细胞周期的作用和很强的诱导细胞凋亡的能力〔3〕，本课题组率先通过控制剂量将其用于抗肿瘤研究，前期工作已观察了MMC对脑胶质瘤〔4〕及白血病〔5〕的治疗作用，且取得较好疗效。本实验旨在探讨MMC对小细胞肺癌细胞周期的影响，为MMC进一步应用于肺癌脑转移治疗奠定实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源

　　人小细胞肺癌细胞株(NCIH446)由吉林省肿瘤医院肿瘤研究所赠送。氯化甲基汞(MMC)由德国Merck公司生产，三氧化二砷(As2O3)由美国Alfar Aesar公司生产，顺铂(DDP)由山东齐鲁药厂生产;FACSAN流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)由美国BD公司生产。

　　1.2 体外实验

　　NCIH446细胞复苏后以含10%小牛血清、100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM培养液培养，培养条件为37℃，5%CO2和100%饱和湿度，用0.25%胰酶消化传代，每3～4 d换液传代一次。将细胞接种于24孔培养板中，1×105个/孔，于37℃，5%CO2饱和湿度培养24 h，待细胞完全贴壁后，分别加入终浓度为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L MMC、As2O3、DDP，每一浓度3个平行孔，继续培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，悬浮细胞离心(1 500 r/min，5 min)，将收集细胞用PBS洗两次，1 500 r/min离心5 min;加80 μl RNase和80 μl PI，4℃避光孵育20 min，FCM检测和分析细胞周期。

　　1.3 统计学处理

　　计量资料用x±s表示，采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 流式细胞仪检测结果

　　用不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)MMC处理NCIH446细胞48 h后，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞数目明显增多(P<0.05);S期细胞数目明显减少(P<0.05)，且与药物浓度呈负相关，当接触20.0 μmol/L时，S期降至1.01%，G2/M期细胞数目无明显变化(见表1)。表1 MMC干预48 h后对NCIH446细胞周期的影响(略)

　　2.2 As2O3对NCIH446细胞细胞周期的影响

　　流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测结果显示：NCIH446细胞接触不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)As2O3 48 h后，S期细胞数目明显减少，且随着药物浓度的增加，进一步减少，至20.0 μmol/L时，由对照组的59.62%降至2.87%;同时，G2/M期细胞数目逐渐增加，呈现G2/M期阻滞(见表2)。

　　2.3 DDP对NCIH446细胞细胞周期的影响

　　流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测结果显示：NCIH446细胞接触不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)DDP 48 h后，S期细胞数目明显减少，且随着药物浓度的增加，进一步减少，至20.0 μmol/L时，由对照组的59.62%降至2.38%;同时，G0/G1期细胞数目逐渐增加，呈现G0/G1期阻滞(见表3)。表2 As2O3干预48 h后对NCIH446细胞周期的影响(略)表3 DDP干预48 h后对NCIH446细胞周期的影响(略)

　　2.4 MMC、As2O3、DDP对NCIH446细胞细胞周期影响的比较

　　MMC、As2O3、DDP三者中，MMC与DDP对S期的抑制作用相似，且都强于As2O3，经统计学分析差异有显著性，接触浓度为5 μmol/L时，P<0.001;浓度为2.5 μmol/L时，P<0.01;浓度为1.25和10 μmol/L时，P<0.05(见图1)。

　　3 讨 论

　　研究表明，细胞的增殖、分化、衰老和凋亡均是细胞周期依赖性的。机体细胞增殖失控与肿瘤的发生有密切的关系，而细胞的增殖失控又是细胞周期调控异常的结果。抗肿瘤药物常常通过干扰正常的细胞周期进程，使肿瘤细胞不能完成正常的细胞增殖来达到抗肿瘤的目的，而凡是通过影响细胞周期的生化条件或细胞周期调控机制，干扰细胞周期进程，使肿瘤细胞不能完成正常的细胞增殖或致肿瘤细胞死亡的药物，都可发挥抗肿瘤作用。

　　本研究发现正常生长状态下的NCIH446细胞大多数处于S期，部分处于G0/G1期和G2/M期。MMC、As2O3、DDP均能使细胞周期发生明显改变：MMC、DDP表现为G0/G1期明显增加，且呈剂量依赖性，S期的细胞数明显减少，也呈剂量依赖性;As2O3组细胞表现为明显的G2/M期增加，S期细胞数减少，同样呈剂量依赖性，与文献报道〔6，7〕相符。即：(1)三者均使S期明显减少，以MMC组的减少最明显;(2)MMC、DDP组细胞大部分被阻滞于G0/G1期;As2O3组细胞大部分被阻滞于G2/M期。

　　S期是细胞周期的关键时刻，S期比例反映了肿瘤的增殖活性。在此期，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。本实验中，MMC、DDP、As2O3三者均使S期明显减少，说明他们确可抑制NCIH446细胞的增殖活性。MMC使细胞阻滞于G0/G1期，进入S期的细胞数明显减少，DNA复制受阻，从而细胞不能增殖，甚至死亡;DDP与MMC的作用机制相同;As2O3使细胞阻滞于G2/M期，从而进入下一周期的S期细胞减少，DNA复制受阻，也使细胞不能增殖，甚至死亡。

　　细胞G1和G2期阻滞的机制不同，G1期阻滞主要涉及DNA模板的真实性，防止受损基因被复制，阻滞可能是这种保护反应中的一个环节，可提供充足的时间来促使受损伤的DNA在进入DNA合成和复制的S期前得以修复，损伤严重者可通过凋亡等方式除掉DNA异常的细胞;G2期阻滞则是对复制后的DNA进行检查与修复，防止损伤的染色体进入子代细胞〔8〕。细胞周期进程中发生的周期阻滞对于正常细胞而言是维持其基因组DNA完整性的保护性机制之一，因为在绝大数生物体的整个生命过程中，DNA损伤是一个永远存在的刺激，无论是真核生物还是原核生物都能对基因毒性刺激做出保护性反应，从而保证了基因组的遗传稳定性。如果DNA在周期进程中出现损伤，细胞会启动周期阻滞机制以提供时间修复DNA损伤，但周期阻滞后损伤仍不能修复，就会刺激细胞凋亡来终结，从而降低了基因组不稳定性，减少了肿瘤的发生〔9～11〕。有文献报道，使用去周期阻滞药物接触肿瘤细胞的周期阻滞机制后，可明显增加肿瘤细胞在DNA损伤后的凋亡发生率〔12〕。有认为只有G0/G1期细胞发生凋亡，但更多学者认为细胞周期各时相皆可发生凋亡〔13〕。因此，在一个完整的细胞周期中，细胞随时决定是否完成分裂，还是为修复损伤停滞生长，或是损伤太严重无法修复而发生细胞凋亡。

　　【参考文献】

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