N-乙酰半胱氨酸和川芎嗪对博莱霉素诱导的肺纤维化和TGF-β的影响

　　作者：张景鸿, 涂明利, 雷怀定, 刘为舜

　　[摘要] 目的：探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和川芎嗪对博莱霉素所致小鼠肺间质纤维化的治疗作用及机制。方法：博莱霉素(BLM)制成小鼠肺间质纤维化模型。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),进行病理半定量分析,检测谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量、BALF中转化生长因子-β(TGF-β)水平。结果： NAC和川芎嗪治疗组肺泡炎、纤维化病变均较模型组减轻，7 d时肺组织GSH量较模型组高(P<0.05), MDA含量较模型组低(P<0.05)，7、14 d时TGF-β蛋白水平较模型组低(P<0.05)。结论：NAC和川芎嗪可提高肺组织GSH含量，降低MDA生成，使肺泡炎和肺纤维化病变减轻。NAC和川芎嗪通过抗氧化作用，减少TGF-β产生，是其治疗肺纤维化的机制之一。

　　[关键词] 肺纤维化;博莱霉素;N-乙酰半胱氨酸;川芎嗪;TGF-β;小鼠

　　The Effect of N-acetylcysteine and Tetramethylpyrazine on Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis and TGF-β

　　ZHANG Jin-hong, TU Ming-li, LEI Huai-din, LIU Wei-shun

　　(Department of Respiratory diseases, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000, China)

　　Abstact: Objective To investigate the therapeutic effect of N-acetylcysteine and tetramethylpyrazine in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice and explore its mechanism.Methods Fifty male Kunming mice were randomly categorized into four groups:the bleomycin(BLM) group,the N-acetylcysteine(NAC) treated group, the Tetramethylpyrazine treated group and the control group.Pulmonary fibrosis model was induced by intratracheal instillation of single dose BLM 5 mg?kg-1 in mice. NAC and Tetramethylpyrazine treated group were given with NAC 80 mg?kg-1 and Tetramethylpyrazine 40 mg?kg-1， respectively.The animals of the above three groups were killed on the 7th,the 14th and the 28th day after intervention， respectively. The mice in control group was instillated with saline intratracheally and killed on the 7th day.Pathological changes,levels of glutathione (GSH) and Malonyldialdehyde(MDA) in lung tissue,transforming growth factor-β(TGF-β) protein levels in BALF were determined. Results Attenuation of alveolitis and lung fibrosis after treatment with NAC and Tetramethylpyrazine was shown in pathogocal section(P<0.05). GSH was increased and MDA was decreased in lung tissue on the 7th day(P<0.05) in NAC and Tetramethylpyrazine treated group. TGF-β in BALF was increased in the early stage of pulmonary fibrosis and reduced after treatment with NAC and Tetramethylpyrazine(P<0.05).Conclusion NAC and Tetramethylpyrazine may increase GSH and decrease MDA. NAC and tetramethylpyrazine inhibit alveolitis and fibrosis by decreasing oxygen free radicals and TGF-β.This might be one of the mechanisms of antioxidant treatment in pulmonary fibrosis. It is suggested that antioxidant might be a therapeutic drug for pulmonary fibrosis.

　　Key words: Pulmonary fibrosis; Bleomycin; N-acetylcysteine; Tetramethylpyrazine; TGF-β; Mouse

　　肺纤维化是临床常见病理改变，是多种不明病因肺间质疾病的共同结局，往往导致肺功能障碍及呼吸衰竭，近年来其发病更有增多趋势。但该病发生机制尚未完全明了，治疗效果尚不理想，患者常因呼吸衰竭而死亡。近年来研究表明，氧化――抗氧化失衡是肺纤维化机制之一。肺纤维化早期为肺泡炎，由肺泡炎最终出现不可逆肺纤维化。肺泡炎表现为组织损伤和炎症病变，氧自由基释放，使氧化――抗氧化系统失衡，造成肺损伤，促进肺纤维化发生。本实验以博莱霉素(BLM)所致小鼠肺间质纤维化为模型，观察NAC和川芎嗪对抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的作用，以及对TGF-β的影响，探讨抗氧化剂对肺间质纤维化的干预作用及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物雄性昆明小鼠，体重18~22 g。实验前置于20~25 ℃的空调房间。给予复合饲料，饮水不限。

　　1.2 主要药品和试剂博莱霉素：每支15 mg，日本化药株式会社生产，批号X20270。富露施(即N-乙酰半胱氨酸颗粒)，海南金晓制药有限公司生产，批号02803/02。利川(盐酸川芎嗪注射液)，安徽双鹤药业有限责任公司，批号0308021D。GSH测试盒(南京建成生物科技研究所)。MDA测试盒(南京建成生物科技研究所)。小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 (上海森雄科技实业有限公司)。3%戊巴比妥钠、甲醛、生理盐水等。

　　1.3 主要仪器和设备721可见光分光光度仪(上海)。超低温冰箱(SANYO ULTRA LOW NDF-382,日本)。高速冷冻离心机(KDC-160HR,科大创新公司)。恒温水浴箱、组织匀浆机、冷冻管等。

　　1.4 动物分组和标本收集处理雄性昆明小鼠50只，随机分为4组。BLM模型组：15只，小鼠气管内一次性注入BLM 5 mg/kg，按陈祥银等[1]报道的方法制成肺间质纤维化模型;NAC治疗组：15只，模型制作同博莱霉素模型组，给予胃管内注入NAC 80 mg/kg，每日一次;川芎嗪治疗组：模型制作同博莱霉素模型组，给予腹腔注射川芎嗪40 mg/kg，每日一次。上述三组分别于灌注BLM后第 7、14、28 d各组处死动物5只。对照组：5只，小鼠气管内注入等量生理盐水，7 d后处死。动物处死后，气管内进行灌洗收集BALF，取出双肺组织，右肺经10%甲醛固定，进行HE和Masson三色染色;左肺存于Eppendorf管，置-80 ℃保存，供测GSH和MDA。BALF存于-80 ℃保存，供测TGF-β用。

　　1.5 检测指标和方法肺组织匀浆GSH、MDA的检测：按GSH、MDA检测试剂盒说明书严格操作。ELISA法检测BALF中TGF-β蛋白量，根据试剂盒提供的方法进行反应，终止反应后用酶联仪测450 nm光密度(OD)，结果与标准曲线比较确定TGF-β含量。肺组织病理分析：肺组织经不同浓度酒精常规脱水、石蜡包埋、切片后，分别予以HE和Masson三色染色。根据Szapiel[2]提供的方法确定肺泡炎和肺纤维化程度，进行病理半定量分析。

　　1.6 统计学处理应用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，进行F检验和q检验，病理半定量结果采用非参数秩和检验。P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般情况观察对照组动物活泼,反应灵敏,皮毛光滑，无1例死亡。模型组小鼠懒动,反应迟钝,取食减少，死亡2例。NAC组及川芎嗪组小鼠精神、食欲、毛色及活动均好于模型组，两组各死亡1例。

　　2.2 病理观察病理标本经HE染色和Masson染色分别显示肺泡炎及肺纤维化程度。对照组肺泡结构正常，未见肺泡炎及肺纤维化病变(图1)。BLM模型组7 d时，肺泡腔及肺间质大量炎性细胞浸润，肺泡壁水肿，出现严重的肺泡炎改变(图2);28 d时肺间质成纤维细胞聚集，胶原沉积增多，肺泡结构破坏，形成肺纤维化(图5);14 d时病变介于7 d和28 d之间。NAC组、川芎嗪组与同期模型组比较，肺泡炎及肺纤维化程度减轻，病变范围缩小(图3、4、6、7)。病理半定量结果经非参数秩和检验示：模型组7、14、28 d与对照组比较，有显著性差异(P<0.05)。NAC组、川芎嗪组7 d与模型组7 d比较，肺泡炎有显著性差异(P<0.05);14、28 d与同期模型组比较，肺泡炎及肺纤维化均有显著性差异(P<0.05)(表1)。

　　2.3 肺组织中GSH、MDA量测定模型组7 d时肺组织GSH量比正常低，与对照组比，有显著性差异(P<0.01);NAC和川芎嗪组7 d GSH值较模型组升高，差异有显著性(P<0.05)。14 d、28 d时模型组GSH值仍低于正常，但无显著性差异(P>0.05)。模型组7 d时肺组织MDA值升高，与对照组比较，差异有显著性(P<0.01);NAC组、川芎嗪组MDA值比模型组下降，有显著性差异(P<0.05)。14 d、28 d时模型组MDA量基本恢复正常(表2)。

　　2.4 BALF中TGF-β蛋白水平测定模型组7 d、14 d时，BALF中TGF-β1水平升高，与对照组相比，有显著性差异(P<0.01)，高峰位于7 d时。NAC组和川芎嗪组7 d、14 d TGF-β1量与模型组同期比均有所下降，差异有显著性(P<0.05)。各组28 d TGF-β1 值均下降，差异无显著性(表3)。

　　表1 各组肺泡炎及肺间质纤维化分级病理半定量结果比较 (略)

　　注：与同期模型组比较，*P<0.05;与对照组比较，ΔP<0.05。

　　表2 各组肺组织GSH、MDA量比较(略)

　　注：与同期模型组比较，*P<0.05;与对照组比较，△P<0.01

　　表3 各组 BALF中TGF-β1蛋白水平测定值比较(略)

　　注：与同期模型组比较，*P<0.05; 与对照组比较，ΔP<0.01

　　3 讨论

　　肺纤维化首先是炎症细胞和免疫效应细胞在肺泡和间质聚集并持续存在,导致损伤及不适当的修复过程,最终表现为间质细胞增生及细胞外基质(ECM)过度沉积。近年研究表明，氧化损伤是其发生重要机理。肺泡炎时肺泡巨噬细胞及中性粒细胞在下呼吸道的聚集引起肺脏氧负荷过重，并可增加氧自由基的释放,导致肺内氧化抗氧化物质失衡，引起上皮细胞的损伤，促进肺纤维化的发生。肺脏通过损失GSH抵抗氧化损伤而保护自身。谷胱甘肽(GSH)及其还原酶构成肺内主要的抗氧化系统。在抗氧化反应过程中,大量抗氧化剂(包括GSH)被消耗。丙二醛(MDA)是氧自由基攻击细胞生物膜中多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化的产物。测试MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞受损伤的程度。本实验模型组7 d时肺匀浆GSH值比正常低,MDA值升高，与对照组有显著性差异(P<0.01)，说明氧化损伤参与了肺泡炎期的肺损伤过程。肺纤维化时 ECM的过度沉积涉及到细胞、细胞因子、ECM代谢等因素间的相互作用,是一个多因素、多步骤、多环节的错综复杂的进行性病变过程[3]。多种细胞因子在纤维化形成过程中构成复杂的细胞因子网络。肺纤维化也就是肺损伤修复过程中促进纤维化和抑制纤维化两大类因子的作用失去平衡而导致肺功能受损的病变[4]。TGF-β是最重要的细胞因子，能刺激成纤维细胞合成细胞外基质成分,抑制对新合成的基质蛋白产生的酶解作用[5]。本实验BLM模型组BALF中TGF-β水平升高。7 d、14 d时与对照组相比，有显著性差异(P<0.01)。NAC以往广泛应用于COPD祛痰的辅助治疗。近年来，NAC的抗氧化活性受到了重视。Gillissen[6]和Rahman[7]报道，NAC通过对活性氧(ROS)的清除、抑制炎性细胞在肺内浸润和细胞因子的产生，对ALI/ARDS有明显的保护作用。Behr[8]发现，口服NAC 600 mg,3次/日治疗肺纤维化，使BALF和ELF中GSH水平升高，患者肺功能也有一定改善。这表明NAC具有提高肺内抗氧化物的作用。川芎为常用的活血化瘀中药，其化学成分主要有四甲基吡嗪即川芎嗪。研究发现川芎嗪能直接清除具细胞毒性作用的自由基[9],对大鼠肺纤维化模型和特发性肺纤维化有防治作用。但从抗氧化及对细胞因子影响的角度探讨其抗肺纤维化机制，研究较少。本实验以NAC和川芎嗪作为抗氧化剂，观察对BLM致小鼠肺纤维化的干预作用。治疗组与模型组比GSH上升,MDA下降,7 d与模型组同期相比有显著性差异(P<0.05)，表明两者发挥了抗氧化作用，减轻早期肺泡炎阶段的氧化损伤;并使TGF-β下降，7 d、14 d与同期模型组有显著差异(P<0.05)。随着炎性细胞浸润减少，成纤维细胞增多，肺泡炎转为肺纤维化期，TGF-β表达下降。28 d时TGF-β蛋白量各组间无显著差异。两药并且使BLM所致肺泡炎和肺纤维化病理改变减轻，半定量分析差异有显著性(P<0.05)。NAC和川芎嗪两组间差异无显著性。目前认为氧自由基刺激激活细胞转录因子NF-κB[10]，上调细胞因子包括TGF-β的产生。NAC和川芎嗪通过抗氧化作用使氧化损伤减轻，抑制了活性氧刺激的NF-κB的激活，使致纤维化细胞因子TGF-β表达下降，最终减轻了肺间质纤维化。

　　综上所述，氧化抗氧化失衡参与了肺间质纤维化的形成;抗氧化剂NAC和川芎嗪提高肺组织GSH含量，降低MDA生成，使肺泡炎和肺纤维化病变减轻。NAC和川芎嗪通过抗氧自由基，减少TGF-β产生，是其治疗肺纤维化的机制之一。抗氧化剂是对肺纤维化治疗可供选择的一种药物。

　　(文中图1~7见封三)(略)

　　[参考文献]

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　　[2] Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

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　　[5] 蔡后荣,戴令娟,郑培德,等.博莱霉素致肺纤维化中TGF-β表达[J].上海免疫学杂志,2001,21(2):95-97.

　　[6] Gillissen A,Nowak D.Characterization of N-acetylcysteine and ambroxol in anti-oxidant therapy[J].Respir Med,1998,92(4):609-623.

　　[7] Rahman Q,Abidi P,Afaq F,et al.Glutathione redox system in oxidative lung injury[J].Crit Rev Toxicol,1999,29(6):543-568.

　　[8] Behr J,Degenkolb B,Krombach F,et al.Intracellular glutathione and bronchoalveolar cells in fibrosing alveolitis: effects of N-acetylcysteine[J].Eur Resoir J,2002,19(5):906-911.

　　[9] 张兆辉，余绍祖，王镇涛，等.四甲吡嗪对活性氧自由基的清除作用[J].中国药理学报,1994，15(3)：229-231.

　　[10] Frank M,Anthory M.NF-kB as a primary regulator of the stress responses[J].Oncogene,1999,18:6 163-6 171.

　　(郧阳医学院附属太和医院呼吸内科,湖北 十堰 442000)