雌激素受体在支气管哮喘患者肥大细胞上的表达及其意义

　　作者：程 立1,4, 刘先胜4*, 王成国1, 程范军2, 朱正鹏3 作者单位：(郧阳医学院附属东风医院1呼吸内科;2血液内科;3病理科,湖北 十堰 442008;4华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科,湖北 武汉 430030)

　　【摘要】 目的：研究雌激素受体在支气管哮喘患者支气管粘膜肥大细胞中的表达及意义。方法：采用抗人肥大细胞类胰酶单克隆抗体、抗人雌激素单克隆抗体对12例支气管哮喘患者支气管粘膜标本进行免疫组化及双标免疫染色。结果：雌激素受体阳性细胞与肥大细胞相似、位置相吻合。结论：支气管哮喘患者的支气管粘膜中肥大细胞表达雌激素受体，提示雌激素参与呼吸道变态反应以及炎性疾病。

　　【关键词】 支气管哮喘;肥大细胞;雌激素受体

　　The expression of Estrogen Receptors in Mucosal Mast Cells in Bronchial Asthma Patients and its Clinical Significance CHENG Li1,4,LIU Xiansheng4*,WANG Chengguo1,CHENG Fanjun2,ZHU Zhengpeng3 (1Department of Respiratory Diseases,2Department of Hematology,3Department of Pathology,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442008;4Department of Respiratory Diseases,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

　　Abstract: Objective To explore the expression of estrogen receptors in mucosal mast cells in bronchial asthma patients and its clinical significance.Methods With monoclonal antibodies against human mast cell pancreatin and human estrogen receptors,immunohistochemical and dual immunostaining methods were used to detect and locate mast cells from 12 cases of bronchial asthma mucosal specimens.Results The estrogen receptor positive cells were coincided highly with mast cells in morphology and location.Conclusion The expression of estrogen receptors in mucosal mast cells in bronchial asthma patients indicates that estrogen may involve in respiratory allergy and inflammatory diseases.

　　Key words: Bronchial asthma;Mast cells;Estrogen receptor

　　肥大细胞是变态反应和炎性反应中的关键效应细胞。有报道发现女性支气管哮喘患者的呼吸道症状随卵巢激素水平变化而变化[1-2]。也有研究证实雌激素及其受体在变态反应和炎性反应性疾病中起重要作用[1-4]。人上呼吸道变态反应和炎性反应疾病的粘膜组织含有大量的雌激素受体(Estrogen receptor，ER)阳性细胞，其形态、大小和组织分布颇与肥大细胞相似[5-6]。但人类下呼吸道粘膜肥大细胞是否有雌激素受体存在尚未证实。本研究通过免疫组化染色方法测定支气管哮喘患者的支气管粘膜中肥大细胞是否存在雌激素受体，以探讨雌激素是否参与呼吸道变态反应和炎性反应性疾病的病理及发生机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织标本

　　12例接受经纤维支气管镜活检的支气管哮喘患者(符合GINA2006诊断标准)，其中男5例，女7例，年龄23～46岁。每位患者钳取粘膜组织2块，大小约3 mm×2 mm×2 mm，福尔马林固定，石蜡包埋待用。

　　1.2 试剂

　　即用型链酶亲和素生物素过氧化酶复合物免疫组化(SABC)试剂盒、SABCAP试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、BCIP/NBT显色试剂盒、氨丙基三乙氧剂硅烷(APES)切片粘合剂(武汉博士德生物工程公司);抗人肥大细胞类胰酶单克隆抗体(深圳晶美公司);抗人雌激素单克隆抗体 (福建迈新公司)。单抗均以Tris缓冲液(TBS，pH 7.4)稀释至工作浓度1∶100。

　　1.3 免疫组化染色方法

　　行肥大细胞、雌激素受体免疫组化染色。石蜡标本连续切片，厚度4 μm，经脱蜡水化、灭活内源性过氧化物酶后，0.1%胰酶37 ℃水浴消化20 min，TBS冲洗，非免疫性动物血清封闭，每张切片再滴加50 μL抗人肥大细胞类胰酶单克隆抗体(或抗人雌激素受体抗体)，室温下孵育，加50 μL生物素标记的二抗和即用型SABC，DAB显色。

　　1.4 免疫组化双染方法

　　切片经二甲苯脱蜡，系列酒精水化，依次行阻断内源性过氧化物酶、微波修复抗原、非免疫性动物血清封闭后，滴加浓度为1∶100抗人肥大细胞单克隆抗体，37 ℃孵育30 min，TBS液洗涤;滴加50 μL生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min;滴加浓度为1∶100 SABC 37 ℃45 min;采用DAB显色试剂盒显色;滴加双摘阻断液，并行血清封闭后，滴加50 μL抗人雌激素单克隆抗体，37 ℃水浴30 min;滴加50 μL生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min;滴加即用型SABCAP液，37 ℃ 45 min;采用BCIP/NBT避光显色3～20 min呈紫蓝色后，以蒸馏水充分洗涤终止反应。

　　1.5 判定标准及结果分析

　　MC判定标准:tryptase阳性细胞呈棕黄色，胞浆内可见棕黄/褐色颗粒，胞核亦呈棕黄/褐色。MC计数方法:参照Molin[7]方法,高倍镜下随机观察10个视野，计数各视野内MC数，求其均值。

　　ER阳性判定标准[8]:以细胞内有棕黄色颗粒,且着色明显高于背景者定为ER阳性细胞，高倍镜下选取10个不同视野,计数各视野内ER阳性细胞数，求其均值。

　　通过连续切片光镜下对ER阳性细胞和MC进行对比观察，并分析两者的相关性。ER阳性细胞和肥大细胞相关性判定：用连续切片对ER阳性和肥大细胞的数目和组织分布进行对比观察，每张切片选择5个含有最多阳性细胞的高倍视野进行计数，每份标本的阳性细胞数以平均阳性细胞数/高倍视野表示。

　　1.6 统计分析

　　两者之间的相关性用Towtailed Pearson Bivariate相关分析处理(SPSS11.0)，并进行t检验，P<0.05时被认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肥大细胞、雌激素受体阳性细胞染色结果

　　光镜下MC为圆形或椭圆形，被染成棕黄色，呈弥散分布，以血管周围多见;胞浆内可见棕黄/褐色颗粒，胞核亦呈棕黄/褐色，其周围可见散在分布的tryptase阳性颗粒，ER阳性细胞主要是细胞核被染成棕黄色的ER阳性细胞。间质中的ER阳性细胞与MC的形态特征相似(见图1～2)。

　　2.2 雌激素受体阳性细胞与肥大细胞相关性

　　雌激素受体阳性细胞与肥大细胞形态学特征有相似之处;MC计数5.67±4.35，ER阳性细胞计数15.16±7.49，其中间质中的ER阳性细胞为3.84±3.08。MC与粘膜间质中的ER阳性细胞存在正相关，相关系数为0.845(P<0.01)。

　　2.3 支气管粘膜肥大细胞可表达雌激素受体

　　免疫组化双染结果示：镜下可见粘膜肥大细胞被染成棕红色，雌激素受体位于肥大细胞胞浆中，并被染成深蓝色，与细胞位置吻合(见图3a、3b)。

　　3 讨论

　　雌激素具有促进抗体生成、增强肥大细胞释放组织胺、延迟嗜酸性细胞凋亡和嗜酸性细胞趋化作用。以往研究证实，应用雌激素可使哮喘、过敏反应、自身免疫等疾患症状恶化[9-11]，并可加重支气管哮喘患者焦虑抑郁状态[12]。雌激素亦可通过诱导生长因子受体的表达，使肥大细胞数目增多[13]，并能增强肥大细胞释放组织胺能力[14]。上述结果提示雌激素可通过改变肥大细胞的功能引起气道高反应性或者支气管哮喘，故推测肥大细胞可能是连接雌激素和气道高反应性或者支气管哮喘之间的重要纽带。但目前关于雌激素对呼吸道变态反应的靶点和可能的细胞学机制仍未阐明。

　　抗人肥大细胞类胰酶抗体标识肥大细胞是目前检测肥大细胞数目和活性的先进方法，具有很高的特异性和敏感性。目前免疫组化染色法因能在组织原位显示雌激素受体信号并排除因非相关蛋白污染而造成假阳性的可能，故被认为是最好的方法。本研究运用该方法，在同一标本连续切片上观察细胞的位置和形态，发现雌激素受体阳性细胞似与肥大细胞吻合，相关分析处理，两者相关系数为0.845，证明该方法成功可靠 。

　　Zhao等[15]应用免疫组织化学法检测鼻息肉内雌激素受体的表达，发现除肥大细胞外，巨噬细胞、淋巴细胞等其它免疫细胞均不表达雌激素受体。Harnden等[16]在研究间质性膀胱炎的膀胱粘膜时也发现肥大细胞单独表达雌激素受体。Mollerup[5]和Fagan[6]发现人上呼吸道变态反应和炎性反应疾病的粘膜组织含有大量的雌激素受体，其形态、大小和组织分布与肥大细胞相似，但支气管哮喘患者支气管粘膜肥大细胞是否也存在雌激素受体未知。本研究采用抗人肥大细胞类胰酶单克隆抗体、抗人雌激素单克隆抗体对支气管粘膜标本进行了免疫组化双标染色，结果证实支气管哮喘患者的支气管粘膜中肥大细胞表达雌激素受体。

　　本研究中，每例肥大细胞和ER阳性细胞表达的强弱不同，同一标本的连续切片上肥大细胞和ER阳性细胞的积分也不同。尽管肥大细胞和ER阳性细胞明显相关，但肥大细胞阳性积分高于ER阳性细胞者占多数(56%)，表明并非所有肥大细胞均可恒定地表达雌激素受体，而这种表达上的差异是否与肥大细胞异型性有关则需进一步研究。

　　所有类固醇激素都是通过结合相应受体作用于靶细胞而发挥生物效应的，组织中相应受体的存在是组织对该激素敏感的最好标志，这一结果不仅为雌激素对呼吸道的作用提供了直接的免疫学依据，而且对揭开雌激素参与支气管哮喘等呼吸道变态反应以及炎性反应疾病的发病机理将有理论和实用价值。本研究结果也可能有助于解释支气管哮喘在女性围月经期加重的现象。

　　(文中图1～3见封二)

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