雄性大鼠肺组织中雌激素受体的研究

　　作者：林勇，孙思庆，朱晓莉，张蔷(东南大学附属中大医院呼吸科，江苏南京 210009)

　　Combination of octreotide with specific cyclooxygenase-2inhibitor enhances the inhibitory effect on growth of human hepatocellular carcinoma

　　YU Qian，SUN Wei-hao，LIU Shun-ying，OU Xi-long，CAO Da-zhong，SU Han，JIANG Jie，YU Ting

　　(1.Department of Gastroenterology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China;2.Department of Geriatrics，the First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing210029，China)

　　Abstract:Objective To investigate the effects of a special COX.2inhabitor(NS.398)and somastotatin analog(oct-reotide)on the proliferation and apoptosis in a HCC cell line，SMMC.7721;tofocus on observing the effects of combination treatment of NS.398and octreotide on antiproliferation and induction of apoptosis in SMMC.7721.Methods Cell growth and proliferation of SMMC.7721were analyzed with MTT assay;apoptosis was detected with flow cytometry assay.Results (1)NS.398and octreotide inhibited cell growth of SMMC.7721in a time-and dose-dependent manner.The combination of1×10-5 mol?L-1 NS.398and1×10-6 mol?L-1 octreotide inhibited the proliferation more remarkably than either agent applied singularly(P<0.01)，analyzation with Jin Zheng mean square method suggested that q>1.15，and the inhibition rate en-hanced along with the time.(2)In apoptosis cell group，AnnexinⅤpositive cells could be observed with flowcytometry after treatment of NS.398of1×10

　　-5 mol?L-1 ，octreotide of1×10-6 mol?L-1 and the combination of the two group for24h respec-tively.The apoptosis rate of combination group was much greater than that when either one was applied singularly(P<0.01).Conclusion NS.398and octreotide inhibit SMMC.7721from growing in a time-and dose-dependent manner;both NS.398and octreotide induce the apoptosis of SMMC.7721remarkably;the combination of the two has a synergistic effect.Key words:NS.398;octreotide;hepatocellular carcinoma;cell proliferation;apoptosis 东南大学学报 (医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi) 2005，Nov;24(6):368.370

　　[摘要]目的: 研究雌激素受体(ER)在雄性大鼠肺组织的表达和定位。 方法: 采用RT.PCR方法检测大鼠肺组织ER.α、ER.βmRNA的表达，用免疫组织化学方法检测大鼠肺中ER.β蛋白表达定位。 结果: RT.PCR结果显示，在大鼠肺组织中ER以ER.βmRNA的表达为主，ER.αmRNA几乎不表达。免疫组织化学检测结果显示ER.β存在于柱状上皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞上，血管壁上内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达。 结论: ER.β在大鼠肺组织中有广泛的分布。

　　[关键词] 雌激素受体;肺组织;免疫组织化学;大鼠

　　雌激素(estrogen，E)在人体中有重要作用，它主要通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合而发挥生物学作用。本研究旨在探讨ER在雄性大鼠肺组织中的表达和定位。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　雄性SD大鼠由东南大学医学院动物实验中心提供，平均体重(254.0±3.9)g，日龄70d左右。RNA提取试剂Tripure为Roche Applied Science公司产品，Ac-cess RT.PCR System试剂盒为Promega公司产品，兔抗大鼠ER.β抗体为Santa Cruz公司产品，Vltra Sensitive S.P超敏试剂盒和DAB显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本制备

　　大鼠经戊巴比妥钠(30mg?kg-1 )腹腔注射麻醉后，取右肺中上叶直接用铝箔纸包裹后先放置在液态氮罐中，后置于-70℃冰箱。标本经10%中性福尔马林溶液固定后，严格于垂直位石蜡包埋;垂直于支气管细支气管断面，矢状位取材，沿肺门横断取材，连续切片，切片厚度5μm，行免疫组织化学染色。 1.2.2 RT.PCR (1)细胞总RNA的提取:用微量天平称取100～200mg肺组织，用2ml玻璃匀浆器在冰浴下制成肺组织匀浆，加入1ml Tripure试剂。按试剂说明书提取细胞内总RNA，紫外分光光度仪(650.60型，日本HITACHI产品)测定其浓度和纯度，重复测定3次，计算样本总RNA浓度:A260 .A280 值在1.8～2.0之间。(2)引物的设计与合成:扩增大鼠ER.α、ER.β和β.actin依据Kuiper等[1] 报道的引物序列由上海申友生物技术有限公司人工合成。ER.α扩增产物长度344bp。ER.α引物:上游引物5′.AAT TCT GAC AAT CGA CGC CAG.3′，下游引物5′.GTG CTT CAA CATTCT CCC TCC TC.3′，ER.β扩增产物长度262bp。ER.β引物:上游引物5′.TTC CCG GCA GCA CCA GTA ACC.3′，下游引物5′.TTC CCG GCA GCA CCA GTA ACC.3′，β.actin扩增产物长度422bp。β.actin:上游引物5′.GAG ACC TCA ACA CCC CAG CC.3′，下游引物5′.TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA.3′。(3)RNA完整性的鉴定:变性甲醛凝胶电泳，显示28S、18S及5S三条带，且RNA28S∶18S为2∶1。(4)RT.PCR和凝胶成像分析:按照一步法RT.PCR试剂盒说明书进行RT和PCR扩增。设立β.actin阳性对照作基因转录的对照。取RT.PCR产物5μl在1.7%琼脂糖凝胶上电泳分离，应用凝胶成像系统(GeneQuant，美国Pharmacia Biotech)照相。

　　1.2.3 免疫组织化学染色

　　切片经3%H2 O2 孵育15min后置于柠檬酸钠缓冲液(CBS，0.01mol?L-1 ，pH6)中，微波(850W)修复抗原至沸腾即止，待缓冲液自然冷却后取出切片，依次滴加A液(过氧化物酶阻断剂)孵育10min、B液(正常羊血清)孵育10min、兔抗大鼠ER.β多克隆抗体(sc.8974，Santa Cruz，1∶100)4℃孵育过夜、C液(生物素标记的羊抗鼠IgG)孵育10min、D液(链霉菌抗生物素蛋白.过氧化物酶溶液)孵育10min，以上各步骤之间用PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。各组切片同时分别用PBS、正常羊血清代替一抗，以上述步骤处理同样切片作为空白对照和替代对照试验。

　　2 结 果

　　RT.PCR结果显示，在大鼠肺组织中ER以ER.βmRNA的表达为主，ER.αmRNA几乎不表达(图1)。免疫组织化学检测结果显示ER.β阳性反应可见于柱状上皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞上，血管壁上内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达，呈棕黄色，主要定位于细胞核(图2)，对照组切片染色结果为阴性，细胞核为苏木素蓝染。

　　3 讨 论

　　本试验利用PT.PCR法发现在肺组织中存在ER.βmRNA，而ER.αmRNA几乎不表达。并且免疫组织化学检测结果显示，ER.β阳性反应可见于柱状上皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞上，在肺血管壁上，内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达，以内皮细胞为多，呈棕黄色，主要定位于细胞核。

　　E是一类有广泛生物活性的甾体激素，它主要通过与ER结合而发挥生物学作用。ER是一种糖蛋白，相对分子质量为35000～90000，具有特异性强、亲和力高和结合容量低的特性。有研究证实E对肺血管重建和右心室肥大均有保护作用[2，3] 。

　　在上世纪70年代，Morishige等首先在大鼠肺组织中发现有ER存在[4]。随后，Singletary等也在雄性大鼠肺组织中发现包含高亲和力的受体样分子[5] 。Kuiper等首先证实在成年大鼠的肺组织中表现出中等量ER.βmRNA，且认为在成年大鼠的肺中存在ER.α和ER.β两种ER，但以ER.β为主[1] 。Saunders等发现在大鼠肺组织中，ER.β存在于上皮细胞核和平滑肌细胞核中[6] 。Maruyama也进一步证实了大鼠肺组织中存在的ER.β[7]。Couse等发现两性小鼠肺组织中ER.βmRNA为ER的主要表现形式，在野生型小鼠雌性和雄性中，ER.β∶ER.α分别为3.1和2.6[8] 。Enmark等发现在人肺实质和肺血管上有ER.β表达但表达量较低[9] 。随后的实验也证实了在人肺组织中存在ER.β[10，11] 。Taylor等利用免疫组织化学法进一步证实，在成年人肺组织中，ER.α存在于基细胞、平滑肌细胞中。而ER.β存在于柱状上皮细胞、平滑肌细胞、间质细胞和基细胞上。同时ER.β在血管壁上内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达[12] 。Fasco等通过试验发现，ER.α在女性肺组织中的表达多于男性，而ER.β在两性肺组织中的表达相似[13] 。

　　本实验证实了ER.β在大鼠肺组织中有广泛的分布，在肺组织内E可能通过β受体这一信号途径发挥多种重要的调控作用。肺血管中ER.β的存在为解释E在肺血管中的作用机制及研究低氧性肺动脉高压的防治提供了分子水平的物质基础，为进一步从分子水平阐述E对肺血管的保护作用提供了一种新途径。

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　　[基金项目] 铁道部科技基金资助项目(J2000Z086);东南大学科学基金资助项目(9247341170)。