阿魏酸钠对大鼠肺纤维化的预防作用

　　作者：穆茂， 程德云， 陈应强， 聂莉， 杨礼腾， 胡晓波， 方询， 陈文彬 作者单位：(贵阳医学院附院 感染科，贵州 贵阳 550004;四川大学华西医院 呼吸内科， 四川 成都 610041)

　　【摘要】 目的： 探讨阿魏酸钠对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的预防作用。方法： 30只SD大鼠随机分为对照组，肺纤维化模型组和阿魏酸钠预防组，每组10只;模型组和预防组以气管内滴入博来霉素(5 mg/kg)建立肺纤维化动物模型，预防组采用阿魏酸钠(150 mg/kg)灌胃治疗;HE染色检测肺组织病理改变及细胞计数，胶原纤维染色检测总胶原纤维表达，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原纤维。结果： 与对照组比较，肺纤维化模型组肺组织内细胞数、肺内总胶原纤维及Ⅰ型胶原纤维均显著增加;阿魏酸钠预防组与肺纤维化模型组比较，肺组织内细胞数、肺内总胶原纤维及Ⅰ型胶原纤维均显著降低。 结论： 阿魏酸钠能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的炎症和纤维化程度，对肺纤维化有一定的预防作用。

　　【关键词】 肺纤维化; 纤维胶原类; 阿魏酸; 博莱毒素; 大鼠，spraguedawley

　　Preventive Effect of Sodium Ferulate on Pulmonary Fibrosis in Rats

　　MU Mao，CHENG Deyun, CHEN Yingqiang， NIE Li, YANG Liteng, HU Xiaobo, FANG Xun, CHEN Wenbin

　　(Department of Infectious Diseases,the Affiliated hospital of Guiyang Medical College ,Guiyang 550004,Guizhou, China;

　　Department of Respiration Internal Medicine, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan, China)

　　[Abstract] Objective: To explore the preventive effect of sodium ferulate on bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats.Methods： Thirty SD rats were randomly divided into control group (group C)，pulmonary fibrosis model group (group M), and sodium ferulate preventive group (group F) with 10 rats in each group. The rat model of pulmonary fibrosis was established by intratracheal injection of bleomycin (5 mg/kg). Sodium ferulate was administered intragastricly in group F with a dose of 150 mg/kg. Lung histopathology and cell amount were examined with HE stained sections; Collagen fibril staining was used to detect total collagen expression, and immunohistochemistry assay was used to detect type I collagen. Results： Cell counts, total collagen expression, and type I collagen quantity were significantly higher in group M than in group C, and were significantly lower in group F than in group M. Conclusions： Sodium ferulate can effectively reduce the degree of inflammation and fibrosis in the lung tissue of rats with plumonary fibrosis, which shows that sodium ferulate has a preventive effect to pulmonary fibrosis.

　　[Key words] pulmonary fibrosis; fibrillar collagens; ferulic acid; bleomycin; rats,spraguedawley

　　肺纤维化(pulmonary fibrosis)是肺组织对各种原因所致肺损伤的创伤愈合反应，是多种弥漫性肺间质疾病的共同病理改变，表现为细胞外基质增多，胶原代谢失衡并在细胞外过度沉积[1]。对肺纤维化的治疗，主要给予肾上腺糖皮质激素和免疫抑制剂，但效果不甚理想且副作用明显，而具有活血化淤功效的中药在防治器官纤维化方面具有良好的应用前景。阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)是当归、川芎等多种中药的有效成分，研究显示，阿魏酸钠对大鼠肝纤维化和肾间质纤维化具有一定的抑制作用[2，3]，但关于阿魏酸钠能否抑制肺纤维化，目前报道较少。2007年2月～4月以大鼠气管内滴入博来霉素建立肺纤维化模型，用阿魏酸钠干预后，观察肺纤维化大鼠肺组织内细胞数、总胶原纤维和Ⅰ型胶原纤维的变化，探讨阿魏酸钠对肺纤维化的预防效应，为治疗肺纤维化提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　动物和试剂 选择7周龄二级健康SD大鼠30只 (四川大学华西实验动物中心提供)，体重150～250 g，雌雄各半;阿魏酸钠(成都亨达药业有限公司)、博莱霉素(15 mg/支)、丽春红S(北京欣经科生物技术有限公司)、维多利亚兰B(上海化学试剂公司)，兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。TE2000u荧光相差倒置生物显微镜，COOLPIX450高级数码相机， Imagepro plus 专业图像分析软件，phyIII型病理组织漂烘处理仪(常州中威电子仪器厂)，LEICA RM2128轮转切片机(德国莱卡公司)，电子天平(美国Sartorius公司)，-85 ℃立式超低温冰箱(美国NUAIRE公司)。

　　1.2 分组

　　30只大鼠随机分为对照组、肺纤维化组和阿魏酸钠预防组，每组10只。肺纤维化模型组和阿魏酸钠预防组大鼠气管内滴入博莱霉素(5 mg/kg，溶于0.3 ml生理盐水)建立肺纤维化大鼠模型，对照组予等量生理盐水气管内滴入。从第2天起，阿魏酸钠预防组大鼠每天给予阿魏酸钠(150 mg/kg，溶于3 ml生理盐水)灌胃，肺纤维化模型组和对照组大鼠予以3 ml生理盐水灌胃,共28 d。

　　1.3 检测指标

　　第29天，处死大鼠，剪左肺下叶于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定后，常规石蜡包埋，切片，分别进行HE染色、胶原纤维染色(采用显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法)，检测肺组织总胶原纤维，免疫组织化学SP法检测I型胶原纤维(操作按照试剂盒说明书进行)。图像采集及分析定量：于HE切片的上下左右四个视野各采集一张100倍的图像，每张图像先进行颜色分离，然后自动计算肺组织内细胞数的积分光密度(IOD)值，4张图像的IOD平均值作为该片肺组织内细胞数的代表值。对胶原纤维染色切片和免疫组化切片，同样先用软件进行颜色分离，然后采用相同的方法分别计算肺组织总胶原纤维和I型胶原纤维的IOD值。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，所测数据以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肺组织病理学

　　对照组：肺组织结构正常，肺泡间隔无明显充血及水肿，肺泡内未见明显炎性细胞;模型组：肺泡间隔明显增宽伴明显充血水肿，重度纤维组织增生，肺泡腔变形，其中含有较多炎性细胞;阿魏酸钠预防组：肺泡结构基本正常，肺泡间隔增宽较模型组明显减轻，炎性细胞浸润较轻，未见明显纤维化改变。见图1。图像分析显示，模型组肺组织内细胞数与对照组相比明显增多，差异有显著性(P<0.001);阿魏酸钠预防组肺组织内细胞数明显低于模型组(P<0.001)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 各组大鼠肺组织细胞数(略)

　　2.2 肺组织总胶原纤维及Ⅰ型胶原纤维

　　显微镜下可见，对照组肺组织结构正常，未见明显胶原纤维染色;与对照组相比，模型组肺泡间隔有大量红色胶原纤维阳性表达，呈条索状弥漫沉积，交织成网;阿魏酸钠预防组也有胶原纤维沉积，但较模型组明显为少。见图2。图像分析IOD值显示，模型组总胶原纤维表达明显高于对照组(P<0.001);和模型组比较，阿魏酸钠预防组总胶原纤维表达显著降低(P<0.001)，而与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。结果见表2。对照组I型胶原纤维仅在气管周围弱表达;而在模型组中，I型胶原纤维广泛分布于支气管上皮下组织、肺间质及血管周围;经过阿魏酸钠预防后，支气管上皮下组织、肺间质及血管周围的Ⅰ型胶原纤维表达明显减少。见图3。模型组Ⅰ型胶原纤维的表达明显高于对照组(P<0.001)，阿魏酸钠预防组较模型组表达减弱，差异有显著性(P<0.001)，而与对照组比较没有明显差异(P>0.05)。结果见表2。表2 各组大鼠肺组织总胶原纤维及Ⅰ型胶原纤维表达(略)

　　3 讨论

　　肺纤维化的主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎和后期大量成纤维细胞的病理性增生及基质胶原纤维进行性积聚，并取代正常肺组织。胶原纤维是肺组织的细胞外基质的主要成分，正常情况下，肺内胶原代谢处于动态平衡，对维持肺间质和肺泡的正常结构和功能起着非常重要的作用。肺间质纤维化时，胶原代谢失衡，胶原于细胞外过度沉积，破坏正常的肺组织结构，使肺功能受损，严重时危及生命[4]。博莱霉素气管内一次性注入制备的肺纤维化大鼠模型，是目前公认的比较符合肺纤维化病理演变的模型[5]。本实验中，HE切片显示模型组肺泡组织明显充血、水肿，肺泡内见大量炎性细胞。细胞数采集结果显示对照组与模型组比较差异有显著性(P<0.01)，表明模型组的炎症和纤维化程度严重。胶原纤维染色表明对照组肺组织无明显异常，肺泡间隔无明显胶原纤维增生，肺泡内未见炎性细胞，仅在气管周围染成红色。模型组大鼠肺内间质胶原纤维明显增多，大量胶原纤维沉积在新生的毛细血管周围，并可见大量炎性细胞浸润。免疫组织化学显示，对照组I型胶原纤维仅在气管周围弱表达，而模型组I型胶原纤维广泛分布于支气管上皮下组织、肺间质及血管周围，且表达较对照组有显著差异(P<0.01)，表明实验成功地复制了博莱霉素诱导的大鼠纤维化模型。

　　阿魏酸钠含当归、川芎等多种中药的有效成分。药理研究认为，阿魏酸钠为非肽类内皮素受体拮抗剂，可拮抗内皮素引起的血管收缩、升压及血管平滑肌细胞增殖的作用，从而可减轻血管内皮损伤，同时还有抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流变学等作用，还具有清除自由基、增强免疫功能等多种药理作用[6]。本研究用阿魏酸钠预防肺纤维化，观察肺组织病理形态学变化，与肺纤维化模型组比较，阿魏酸钠预防组大鼠肺泡结构基本恢复正常，肺泡间隔增宽较模型组明显减轻，未见明显纤维化改变。同时，阿魏酸钠预防组肺组织内细胞数也明显低于肺纤维化模型组，说明阿魏酸钠确能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的纤维化和炎症程度。应用胶原纤维染色和免疫组织化学技术分别对肺纤维化大鼠肺组织总胶原和Ⅰ型胶原进行半定量研究，阿魏酸钠可显著预防肺组织总胶原和Ⅰ型胶原含量的增加，表明阿魏酸钠有明显的抗肺纤维化的作用。

　　综上所述，阿魏酸钠确能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的纤维化和炎症程度，并阻止I型胶原过度沉积，在肺纤维化胶原代谢失衡中具有重要的调控作用，对肺纤维化的防治具有积极的应用前景。

　　【参考文献】

　　[1]Liu R，Ahmed KM，Nantajit D，et a1.Therapeutic effects of alphalipoic acid on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Int J Mol Med, 2007 (6)：865-873.

　　[2]李海强，刘绮，谢明映，等.阿魏酸钠注射液对慢性乙型肝炎肝硬化门脉血流动力学及肝纤维化指标的影响[J].中西医结合肝病杂志，2008 (1)：23-24.

　　[3]粱靖媛，尤冠巧，刘芳，等.阿魏酸钠对TGFβl诱导下肾脏成纤维细胞αSMA、CTGF表达及细胞外基质合成的影响[J].西部医学，2009 (3)：361-365.

　　[4]孔琪，秦川. 肺纤维化的发病机制及关键靶点[J].国外医学.呼吸系统分册，2005(5):331.

　　[5]Clark JG, Kostal KM, Marino BA. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamster. An alveolar macrophage product increases fibroblast prostaglandin E2 and cyclic adenosine monophosphate and suppresses fibroblast proliferation and collagen production[J].J Clin Invest, 1983 (72)：2082-2091.

　　[6]刘向峰，李娜.阿魏酸钠的临床应用[J].宁夏医学杂志，2005 (1)：69-70.