电压依赖性钾通道与哮喘发病机制的相关性研究

　　作者：王忠慧 马忠森 李艳 作者单位：上海市闵行区中心医院呼吸内科 吉林大学第二医院呼吸科 上海 201100

　　【摘要】 目的 探讨钾通道开放剂(KCOs)对组胺作用后电压依赖性钾通道(Kv)及哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞(BSMCs)Kv的作用。方法 利用膜片钳技术细胞贴附式方法测定正常豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的开放时间快慢成分(τfast、τslow)，关闭时间及组胺作用后Kv 的开放时间、关闭时间;哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的开放时间、关闭时间及KCOs对二者的影响。结果 组胺可明显缩短豚鼠BSMCs电压依赖性钾通道开放时间，延长关闭时间，与正常对照组比较差异有显著性(P<0.001);哮喘组与正常对照组比较开放时间τfast、τslow明显缩短，关闭时间延长，二者相比有显著性差异(P<0.001)。KCOs可延长组胺作用后及哮喘豚鼠BSMCs钾通道的开放时间，缩短关闭时间，二者相比有显著性差异(P<0.001)。结论 哮喘豚鼠BSMCs电压依赖性钾通道活性降低，组胺可缩短Kv的开放时间，延长Kv的关闭时间可能为哮喘的发病机制之一。KCOs可增加哮喘豚鼠支气管平滑肌Kv的活性，由此可能达到治疗哮喘的作用。

　　【关键词】 哮喘;组胺;支气管平滑肌;电压依赖性钾通道

　　支气管哮喘是以气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾病，部分或完全可逆的气道阻塞，以及气道壁细胞和分子组成的改变〔1〕。然而关于气道炎症及气道高反应性的确切机制尚不是十分清楚，目前多数研究集中在各种细胞因子、化学因子和炎性介质与哮喘相关性的研究，但是越来越多的证据表明气道的其他组成成分在气道炎症反应中也起重要作用，比如气道平滑肌、上皮细胞及成纤维细胞等〔2〕。电压依赖性钾离子通道(Kv)是在支气管平滑肌细胞上最先被研究的一大类钾离子通道，在参与气道平滑肌功能上起重要作用，组胺主要由肥大细胞分泌，是参与哮喘气道炎症反应的一种重要炎性介质，关于组胺通过何种机制参与哮喘气道高反应性的发生目前还不清楚，我们利用膜片钳技术研究组胺对豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的作用，及哮喘豚鼠支气管平滑肌Kv特性的变化，探讨组胺参与哮喘发生的机制，同时探讨KCOs对哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　健康豚鼠，雌雄不限，体重0.3～0.4 kg，由吉林大学实验动物部提供。

　　1.2 仪器与试剂

　　膜片钳放大器(Dangan 8800 TOTAL Clamp，美国Ason公司)，微电极推制器(日本NARISHIGE公司)，微型计算机软件(Pclamp 6.0美国Ason公司)，微电极拉制器(日本NARISHIGE公司)，JSC-A型多功能超声雾化吸入器(辽宁省鞍山市医疗仪器厂)，数模/模数转换卡(AD/DA Digidata 1200 A/B，美国Ason公司)，低通滤波器(美国Ason公司)。胶元酶(日本制药株式会社)，胰蛋白酶(美国生物公司)，鸡卵清白蛋白(美国Sigma公司)，达尔伯克改良依格尔培养基(DMEM，美国Sigma公司)，组胺及钾通道开放剂Cromakalim(北京化工厂)。

　　1.3 实验分组

　　正常对照组：4只，30个细胞;组胺组(正常组加入组胺，组胺浓度为1 μg/ml)：4只，30个细胞;KCOs作用于组胺组〔正常组加入组胺后再加入KCOs(Cromakalim)，Cromakalim浓度为0.5 mg/ml〕：4只，30个细胞;哮喘组：4只，30个细胞;KCOs作用于哮喘组(哮喘组加入Cromakalim：Cromakalim浓度为0.5 mg/ml)：4只，30个细胞。

　　1.4 哮喘模型的建立

　　哮喘豚鼠动物模型的建立采用常规方法〔3〕。腹腔注射10%卵清蛋白1 ml以致敏，2 w后以1%卵清蛋白喷雾诱发哮喘。对照组腹腔注射和喷雾均采用生理盐水。

　　1.5 支气管平滑肌细胞的急性分离

　　分离豚鼠两侧肺组织中3～4级支气管，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块。加入组织体积30～50倍的0.25%胰蛋白酶，15 min后离心，洗去残酶;加入0.1%胶原酶消化90 min，用尖端抛光的Pasteur吸管反复吹打5 min，用200目的不锈钢纱网过滤，加入DMEM培养液反复冲洗、离心2次，即可得到含支气管平滑肌细胞的细胞悬液。将细胞悬液分装到涂有多聚赖氨酸的小平皿内，静置20 min。通道记录选用细胞膜完整、有立体感、胞体呈梭形的细胞。

　　1.6 支气管平滑肌细胞离子通道的记录

　　采用膜片钳技术的细胞贴附式记录，将支气管平滑肌细胞置于细胞外液(mmol/L)(NaCl 135,KCl 5，CaCl2 1，MgCl2 1，HEPES缓冲盐水 10 mmol/L)，记录用微电极电阻约为3 MΩ。单通道电流经膜片钳放大器放大，探头反馈电阻为10 GΩ。低通滤波器滤波频率为3 kHz。

　　1.7 数据的采集和分析

　　由计算机软件控制产生数字脉冲，经数/模(D/A)转换成模拟脉冲电压信号，控制细胞的膜电位，电流信号通过0.1 GΩ探头，经膜片钳放大器的电流电压转换输入到模/数转换卡变成数字信号，并将信号经Digidata 1200接口的数据采集系统和6.0版PCLAMP信号采集程序输入计算机，不同事件的开放时间、关闭时间用指数拟和求得。采用数字化水平为5～10 kHz，分析忽视水平100～200 μs。

　　1.8 统计学处理

　　数据采用x±s表示，采用t检验，用PATAT程序进行统计处理。

　　2 结 果

　　2.1 正常组与组胺组及KCOs作用后Kv开放时间、关闭时间 正常豚鼠BSMCs加入组胺后Kv开放时间的快、慢成分(τfast、τslow)明显缩短，分别下降到正常对照组的25%、14%，关闭时间延长了31%(P<0.001)。再次加入KCOs后Kv开放时间τfast无明显变化(P>0.1)，τslow明显延长了28%，关闭时间缩短了32%(P<0.001)。提示组胺可降低豚鼠BSMCs的Kv活性，KCOs能够部分恢复Kv的活性(表1)。表1 正常组与组胺组及KCOs作用后Kv开放时间、关闭时间(略)

　　2.2 正常组与哮喘组及KCOs作用后Kv开放时间、关闭时间 哮喘豚鼠BSMCs的Kv开放时间的快、慢成分(τfast、τslow)明显缩短，分别下降到正常对照组的26%、19%，关闭时间延长了39%(P<0.001)。哮喘组BSMCs加入KCOs后Kv开放时间延长、关闭时间缩短，与给药前相比有显著性差异(P<0.001)(表2)。表2 正常组与哮喘组及KCOs作用后Kv开放时间、关闭时间(略)

　　3 讨 论

　　我们利用膜片钳技术细胞贴附式方法测定了正常豚鼠、哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的开放时间及关闭时间，及组胺作用后Kv特性的变化。试验结果显示组胺可以显著缩短Kv的开放时间的快慢成分，延长Kv的关闭时间，提示组胺可以明显降低豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的活性。我们同时检测了哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的开放时间及关闭时间，与正常对照组比较哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv的开放时间明显缩短，关闭时间明显延长，同样提示哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv活性也明显降低。组胺是哮喘发病的重要炎性介质，它是通过怎样的机制参与哮喘气道高反性的发生目前还不是很清楚。文献报道〔4〕采用离体气管环张力实验发现哮喘豚鼠模型中钙激活钾通道、延迟整流型钾通道活性降低，可能在气道高反应中起介导作用。电压依赖性钾通道可能参与吸烟所致气道高反应〔5〕。在正常人支气管平滑肌细胞中加哮喘患者的血清后，电压依赖性钾通道表达及活性明显低于未致敏的平滑肌细胞〔6〕，组胺可能通过降低支气管平滑肌细胞Kv的活性参与哮喘的气道高反应性导致哮喘发病。

　　KCOs是一类选择性增强细胞膜对钾离子通透性的化合物，通过开放钾通道，促进钾外流，使跨膜电位更负、膜超极化、动作电位时程缩短，而产生松弛血管和支气管平滑肌作用〔7〕。哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞Kv活性降低，加入钾通道开放剂Cromakalim后，Kv开放时间延长，关闭时间缩短，提示KCOs能够明显增强哮喘豚鼠BSMCs电压依赖性钾通道活性。同时能够部分增强组胺作用后支气管平滑肌细胞Kv的活性。Cromakalim能够舒张组胺、乙酰胆碱、前列腺素F2а引起的人离体支气管平滑肌的收缩，与舒喘灵、氨茶碱相似〔8〕。吸入KCOs可能通过直接作用于支气管平滑肌而不是通过释放神经递质来抑制组胺诱导的支气管收缩〔9〕。虽然体外试验显示了较好的KCOs缓解支气管平滑肌痉挛的作用，但是由于KCOs较多的心血管副作用而限制了其在临床上的应用，我们期望能够发现选择性更强的KCOs，或改变KCOs的用药方式，比如通过雾化吸人的方式，直接作用于气道平滑肌来治疗哮喘，从而为哮喘的治疗提供新的选择。

　　【参考文献】

　　1 Bousquet J，Jeffery PK，Busse WW,et al.From bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;161:1720-45.

　　2 Howarth PH，Knox AJ，Amrani Y,et al.Synthetic responses in airway smooth muscle〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2004;114:S32-50.

　　3 魏 泓.医学实验动物学〔M〕.成都：四川科学技术出版社，1998:315-7.

　　4 邓世苇，叶 红，金 肆，等.3种钾通道在哮喘豚鼠气道高反应中的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2005;21(10)：1970-3.

　　5 张少华，曹福元，叶 红，等.电压门控性钾通道在吸烟诱发气道高反应中的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2005;21(2)：398-9.

　　6 Zhao LM，Xu YJ，Zhang ZX,et al.Effect of passive sensitization by serum from allergic asthmatic patients on the activity and expression of voltage-dependent delayed rectifier potassium channel in human bronchial smooth muscle cells〔J〕.Chin Med J (Engl)，2004;117(11):1630-6.

　　7 Anderson KE.Clinical pharmacology of potassium channel openers l〔J〕.Pharmacol Toxico，1992;70:244.

　　8 罗雅玲，刘久山，周黎明，等.钾通道激活剂Cromakalim对离体支气管平滑肌的作用〔J〕.中华结核和呼吸杂志，1995;6(18)：149-51.

　　9 Kidney JC，Lotvall JO，Lei Y,et al.The effect of inhaled K+ channel openers on bronchoconstriction and airway microvascular leakage in anaesthetised guinea pigs〔J〕.Eur J Pharmacol，1996;296(1):81-7.