呼吸道感染铜绿假单胞菌RAPD分型与抗生素耐药谱分型比较研究

　　作者：温翠玲 张志华 张秀珑 作者单位：(河北北方学院附属第一医院呼吸科，河北 张家口 075000)

　　【摘要】 目的：调查张家口地区呼吸道感染铜绿假单胞菌的分子流行病学情况，为临床防治提供依据。方法：用随机扩增DNA多态性分析技术对31株铜绿假单胞菌进行分型,并与抗生素耐药谱分型比较。结果：31株铜绿假单胞菌RAPD分型共有9种不同的基因型，其中基因A型17株，占54.8%。抗生素耐药谱分型有6型。结论：基因A型为优势菌株，且为多重耐药，是这一年来张家口地区呼吸道感染的相关菌株，RAPD分型在医院呼吸道感染铜绿假单胞菌流行病学的研究中有较大应用价值。

　　【关键词】 呼吸道感染;铜绿假单胞菌;抗生素耐药谱分型;基因分型

　　Study of Comparison between RAPD Types of Pseudomonas

　　aeruginosa in Respiratory Tract Infection and Drug resistant Spectrum Types

　　WEN Cuiling,ZHANG Zhihua, ZHANG Xiulong

　　Department of Respirology,The First Affiliated Hospital,Hebei North University, Zhangjiakou，075000，Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective：By RAPD technique to find out the infection performance of Pa which caused respiratory tract infections in Zhangjiakou area，provide experimental data for clinical prevention. Methods: Using Random Amplified Polymorphic DNA Analysis (RAPD) technique to make typing of 31 Pseudomonas aeruginosa (Pa),and make comparisons between RAPD typing and drug resistant spectrum typing.Results: All the 31 Pa specimen collected by RAPD typing fell into nine different genotypes. There were 17 belonging to Genotype A, amounting to 54.8%,which were divided into 6 types according to different degrees of antibiotic drugresistance.Conclusion: Genotype A was proved to be the dominant strains and resistant to multiplicity of drugs. It was the relevant type which caused respiratory tract infection in ZhangJiaKou area. So RAPD typing has considerable signficance in the study of molecular epidemiology.

　　【KEY WORDS】 Respiratory tract infection; Pseudomonas aesuginosa; Genotyping; Antibiotic resistance band

　　铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginsa,PA)广泛存在于自然界、医院环境及人体的皮肤、肠道和呼吸道，其营养要求不高，适宜生长在潮湿的环境中，为条件致病菌。近年来，其已是呼吸道标本中最常见的革兰阴性杆菌[1]。其感染主要发生在60岁以上、免疫功能低下及使用抗生素、激素或化疗时导致的院内感染，在感染过程中产生多种毒素和酶，可引起慢性疾病患者的呼吸道感染，甚至败血症，且该菌呼吸道感染的治疗，由于其复杂的耐药机制，生物膜的包裹和多重耐药变得越来越困难，病死率高，近年来受到医学界的高度重视[2]。近年来由于广谱抗生素和激素的广泛使用，铜绿假单胞菌的耐药菌株迅速增加并出现多重耐药菌株，因此对该菌的分型的研究非常必要，建立一种简单、快速、可靠、有普遍实用性的分型方法已迫在眉睫，对医院感染的流行病学研究也有十分重要的意义。本科题采用RAPD技术，调查了本地区呼吸道铜绿假单胞菌的流行情况，将RAPD分型与抗生素耐药谱分型进行比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株来源 2003.11～2004.10月我地区呼吸科住院患者清晨深咳痰,12个月内共分离获得31株引起呼吸道感染的铜绿假单胞菌。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27837。

　　1.2 主要试剂

　　1.2.1 引物 5′GTTGGTGGCT3′dNTPs Taq酶，PCR反应配套试剂购自上海生工生物有限公司

　　1.2.2 琼脂糖、石蜡油购自华美生物工程有限公司

　　1.2.3 其它试剂 苯酚、Tris、 HCl、氯仿、异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、EDTANa2、溴酚蓝、硼酸、EB、NaCl、NaOH等均为国产试剂。

　　1.2.4 培养基 MuellerHinton(MH)肉汤、MuellerHinton(MH)琼脂购自浙江天河生物制品检定所

　　1.3 细菌DNA的制备 将菌体复活后接种于肉汤,37℃过夜培养，离心收集菌体，用酚：氯仿法提取DNA。分光光度计测其浓度和纯度。

　　1.4 结果观察 紫外透射仪上观测结果并摄影，两人各自独立观察，电泳条带数量及位置相同者为一基因型。

　　2 结果

　　2.1 标本分离结果 在同等条件下取样，分离出31株铜绿假单胞菌，均分离自痰液，其中6株来自我院ICU病房，5株来自解放军251医院呼吸科病房，2株来自建国医院病房，其余均来自我院呼吸科病房。

　　2.2 抗生素耐药谱分型结果 将31株铜绿假单胞菌依照抗生素耐药谱分型(见表1)，共分6型。实验表明，抗生素耐药谱为Ⅰ型的菌株为优势菌株，且多重耐药，是近一年来张家口地区呼吸道感染铜绿假单胞菌的主要型别，其它型别为散发。表1 31株铜绿假单胞菌抗生素耐药谱分型注：S—Sensitive; R—Resistance; I—Intermedium

　　2.3 RAPD分型结果：将31株铜绿假单胞菌进行RAPD分型，共有9种不同的基因型。其中基因A型为优势菌株，是这一年来本地区呼吸道感染铜绿假单胞菌的相关菌株，其它8型均为散发。2006年12月温翠玲等：呼吸道感染铜绿假单胞菌RAPD分型与抗生素耐药谱分型比较研究第6期2006年12月河北北方学院学报(医学版)第6期表2 31株铜绿假单胞菌的来源及抗生素耐药谱分型、基因分型结果

　　3 讨论

　　铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，广泛分布于自然界中，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染、医院性感染等途径，尤其在患有某些肺部疾病或免疫功能低下时导致呼吸道感染，该菌感染率高，病情来势凶猛，变化迅速，病死率高。近年来，随着大量广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，耐药菌株逐渐增多并出现多重耐药菌株，铜绿假单胞菌造成呼吸道感染治疗更加困难,原因:①在粘膜寄居部位其毒力因子使其黏附粘膜或异物的能力比较强[2]。②菌落表面形成厚厚的生物被膜保护细菌免受抗菌药物的破坏[3]。③对β内酰胺类抗生素产生耐药机制主要是产生Ⅰ型β内酰胺酶。④金属酶和D2微孔蛋白的丢失是致使该菌耐亚胺硫霉素的原因[4]。因而造成治疗过程中耐药菌株出现，致使清除困难，故早期诊断是非常必要的。本文从RAPD分型及耐药谱的意义、RAPD分型与抗生素耐药谱分型的比较几个方面进行探讨

　　3.1 铜绿假单胞菌RAPD分型意义的探讨

　　RAPD分型技术基本原理是采用适当低的退火温度下，利用随机引物扩增未知序列的染色体DNA，具有简单、快速、可靠、实用性强的特点，利于及时发现和预防医院感染。RAPD分型系统在临床中主要用以鉴别菌株是否同源，即菌株间的相互关系，以发现致病菌在人与人之间的可能传染源、治疗失败或反复感染的原因。本课题采用RAPD技术，对呼吸道分离的铜绿假单胞菌31株进行分型，呈9种基因型，其中A型17株，为优势菌株，而这17株说明这一年来本地区呼吸道感染铜绿假单胞菌主要为A型，为多重耐药菌株，应引起临床的重视,一旦发现多重耐药的患者应注意隔离,以阻止耐药菌株在病房内的交叉感染。

　　3.2 铜绿假单胞菌耐药谱的探讨

　　本课题的抗生素耐药谱试验结果发现：在青霉素类抗生素中，哌拉西林耐药率50%，第一代头孢菌素(头孢唑林)、第二代头孢菌素(头孢呋辛)全部耐药，而第三代头孢菌素(头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松)中，头孢他啶、头孢哌酮的抗菌活性相对较强，但耐药率达45%～50%，试验结果比国内相关报道高，可能与近几年这两种药应用较多有关。其作用机制为第三代头孢菌素具有抗β内酰胺酶作用，并可以与细胞膜上的一种特殊蛋白即青霉素结合蛋白结合，引起细胞形态改变，同时抑制细胞壁的合成，从而导致细胞死亡，但仍可作为治疗铜绿假单胞菌的理想药物[5]。同为三代头孢，头孢噻肟、头孢曲松的耐药率却极高，达75%～85%，这可能与临床长期持续应用这两种药物治疗呼吸道感染有关，目前已很少应用于临床治疗铜绿假单胞菌的感染。喹诺酮类的两种抗生素环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率较低，均在40%左右，与近年来较多文献报道[6]喹诺酮类抗生素的耐药性显著增加(如环丙沙星的耐药率已达70%左右)不符，可能存在地区差别或与我们的样本过少有关。本试验的12种抗生素中，碳青霉烯类抗生素亚胺培南的耐药率最低，说明其具有极强的抗菌活性，也是治疗铜绿假单胞菌呼吸道感染的有效抗生素，研究报道[7],其耐药率也有上升趋势,由于其价格昂贵，在本地区很难临床推广应用。本试验研究发现，4重以上的耐药菌占 67.7%，提示引起呼吸道感染的铜绿假单胞菌耐药性很强，也可能是引起呼吸道感染中铜绿假单胞菌分离率升高及感染者死亡率较高的原因。由于被感染人群机体抵抗力弱，免疫功能低下，临床反复应用广谱抗生素，并且大部分病人是呼吸道分泌物引流不畅的重症病人，是医院铜绿假单胞菌的易感人群和防治的重点对象，因此必须对该菌引起的感染引起高度的重视，合理使用抗生素，对预防院内交叉感染具有重要的意义。

　　3.3 RAPD分型与抗生素耐药谱分型的比较研究

　　许多学者对RAPD分型与耐药谱分型的比较做了大量研究，结果显示，就决定细菌来源而言，RAPD基因分型比抗生素耐药谱分型更有效。本试验也得到类似结果，从表2中可看到，RAPD分型有9种，耐药谱分型只有 6种，RAPD分型相同的，其耐药谱分型大致相同;而耐药谱分型相同的，RAPD分型却不同，如耐药谱分型均为Ⅱ型的菌株基因型可分成A、B、D、E四种型别，表明其遗传关系有差异，说明在耐药谱分型中可被RAPD进一步分型。本研究还发现，呼吸科病房有一病人前后两次分离的菌株耐药谱分型不同，第一次为Ⅰ型，第二次为Ⅲ型，但其RAPD基因分型均为A型，虽是同一株菌，可能由于抗生素压力导致表型的改变，表明RAPD基因分型方法更能证实菌株的相关性。由于细菌的耐药性受多种遗传因子的综合影响，不稳定，耐药谱分型只能为抗生素的使用提供参考性信息，能较好地指导临床用药，仍在各级医院广泛使用。而RAPD分型对种和株的分辨率高，可作为铜绿假单胞菌鉴定和分型的有效手段，可在分子水平上对铜绿假单胞菌呼吸道感染提供病原学及流行病学的研究，在早期发现和预防其交叉感染有重要意义,RAPD分型在医院呼吸道感染铜绿假单胞菌流行病学的研究中有较大应用价值。

　　【参考文献】

　　1 王辉,陈民钧.1994～2001年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁[J].中华医学杂志,2003,83(7):385390

　　2 贾辅忠.绿脓杆菌的感染和预防[J].中国实用内科杂志,1999,19(2):7576

　　3 许美荣,胡丽萍,邓丽华.铜绿假单胞菌5年耐药监测结果及注意事项[J].上海医学检验杂志,2003,18(3):183185

　　4 雷兆文.呼吸道生物被膜病—慢性难治性肺部感染的关键环节[J].国外医学呼吸系统分册,1997,17(4):188189

　　5 梁勇,陈裔.铜绿假单胞菌药物敏感性分析及防治对策[J].中国临床药学杂志,2002,11(6):368369

　　6 陈军.铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展[J].国外医学微生物分册,2002,24(4):3133

　　7 党斌温,张杰,唐明忠,等.下呼吸道感染者痰检出铜绿假单胞菌对亚胺陪南的耐药分析[J].中华结核和呼吸杂志,2005,28(1):5354