存活素在非小细胞肺癌血管形成中的作用

　　作者：阎红娥 刘甡 王静 王春玲 作者单位：佳木斯大学第一附属医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯 154002

　　【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)、癌旁及肺良性病变组织中存活素(Survivin)的表达及其与血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的相互关系。方法 应用免疫组化(S-P)法检测60例NSCLC组织中Survivin、VEGF及MVD,分析Survivin、VEGF及MVD与NSCLC临床病理特征的关系，以及Survivin、VEGF、MVD间的相互关系。结果 NSCLC组织中Survivin阳性率71.66 %，明显高于癌旁及肺良性病变组织(均P<0.01) ，其表达与肿瘤分化程度、TNM分期有关。VEGF在肺癌、癌旁及肺良性病变组织中的阳性率分别为65%和15%(P<0.05 ) ，其表达与肿瘤的T′NM分期及淋巴结转移有关。肺癌、癌旁及肺良性病变组织中MVD值分别为37.21±11.05;18.21±3.83,且MVD值的高低与肿瘤大小、淋巴结转移和T′NM分期有关(P<0.05 )。Survivin在肺癌组织中的表达与VEGF、MVD密切相关，随着Survivin强度的增加VEGF分级及MVD值亦增加。结论 在NSCLC中Survivin表达明显增高，其表达与肿瘤分化、分期有关;Survivin的过度表达与NSCLC的血管生成有关，细胞凋亡与血管生成在肺癌的发生发展中起协调作用。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;存活素;血管内皮生长因子;凋亡;血管密度

　　存活素(Survivin)在肿瘤发生、发展中的作用日益引起广泛的重视。关于Survivin在肺癌组织中的分布、定位，及其与肿瘤血管形成关系的研究少见报道。本实验采用免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌(NSCLC)中Survivin、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况，并用CD34标记微血管密度(MVD)，探讨Survivin、VEGF及MVD与NSCLC诸多临床病理特征之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 研究对象 收集我院2005年1月～2007年6月病理资料完整，其间未经化疗，行手术切除并经病理确诊的NSCLC 60例，其中鳞癌21例，腺癌39例。有淋巴结转移33例，无淋巴结转移27例。高分化21例，中分化22例，低分化17例。TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ期21例。同时加取同期正常肺组织40例作为对照组，包括远离癌组织约5cm的非肿瘤性肺组织及炎性假瘤、错构瘤、结核瘤的正常肺组织。

　　1.1.2 试剂 Survivin、VEGF多克隆抗体，均为美国NEO MARKER公司产品，购自武汉博士德公司,工作浓度1∶100。超敏S-P试剂盒(即用型)及小鼠抗人CD34单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法 采用SP免疫组织化学染色法，所有石蜡标本均行5 μm切片，连续切4片，置60℃烤箱内30 min。所有切片分别经二甲苯脱蜡，无水乙醇及其他不同浓度乙醇脱苯，自来水洗2 min水化。一张切片行HE染色核实病理诊断，其余切片行SABC染色，按试剂盒操作规程进行。以PBS代替一抗作阴性对照，用武汉博士德公司提供的已知阳性切片作阳性对照。

　　1.3 结果判定 光学显微镜下肿瘤细胞浆染色呈淡黄色至棕黄色为Survivin蛋白表达阳性。Survivin表达参照Lu〔1〕的双评分半定量方法：按染色强度计分：0为阴性，l为弱阳性，2为阳性，3为强阳性;再按照阳性细胞所占百分比计分：阳性细胞<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分;两者之和≥2分可判断为阳性。阳性又以分值不同划分:2～3分为(+),4～5分为(),6～7分为()。VEGF免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒状，定位于癌细胞胞质内在染色均匀区，根据阳性细胞数所占百分比分为四级计分〔2〕：①0分为≤5%;② 1分为6%～25%;③2分为26%～50%;④3分为>50%。显色度按细胞着色的深浅计分：①1分为弱着色;② 2分为中等着色;③3分为强着色。两种得分相加，得分<3分为阴性(-);3～4分为弱阳性 (+) ;5～6分为强阳性()。MVD测定参照Weidner〔3〕方法:呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群均为1个血管计数,每张切片在100倍光镜下挑选血管分布最高区域,在200倍视野下计数5个视野中被CD34染成棕黄色的血管数目,取其平均值。

　　1.4 统计学处理 用SPSS 11.0软件包进行χ2检验及方差分析，MVD以x±s表示，应用Spearman等级相关分析软件处理Survivin、VEGF及MVD指标间的相关性。

　　2 结果

　　2.1 Survivin及VEGF与NSCLC临床病理因素的关系 Survivin在NSCLC组织中阳性表达率与患者年龄、有无吸烟、组织学类型无关，而与肿瘤直径、临床TNM分期、癌组织的分化程度、淋巴结转移密切相关。VEGF蛋白阳性表达率与组织学分型、临床TNM分期及有无淋巴结转移相关(表1)。

　　2.2 Survivin、VEGF蛋白及MVD在NSCLC与正常对照组的表达水平比较 60例NSCLC组织中Survivin、VEGF蛋白阳性表达率分别为71.66%和65%，显著高于正常肺组织(均P<0.05)(图1)。CD34染色切片中，阳性细胞着色部位主要是内皮细胞的细胞膜和细胞浆，且胞膜着色重于胞浆。MVD在 NSCLC组织中为37.21±11.05，在正常对照肺组织中为18.21±3.83，二者比较有统计学意义(t值3.79，P<0.05)。

　　表1 Survivin、VEGF表达与NSCLC临床病理因素的关系(略)

　　图1 Survivin、VEGF蛋白表达情况(略)

　　2.3 Survivin、VEGF及MVD在NSCLC中的阳性共表达情况 60例NSCLC组织中VEGF阳性39例，Survivin阳性43例，二者共阳性表达35例，共阴性表达13例，二者的表达呈正相关(χ2=18.562，r=0.560 2)。Survivin 与VEGF阳性表达组MVD值分别为35.46±8.75 和34.15±8.98，均显著高于Survivin 或VEGF阴性表达组(t=4.83;t=3.68，P<0.01);Survivin 、VEGF均表达阳性时MVD值最大，明显大于其他各组(P<0.01 )，而Survivin 、VEGF均为阴性时，MVD值最小;随Survivin和VEGF表达增强，MVD值显著升高(P<0.01 );Survivin、VEGF均阳性组织与Survivin、VEGF均阴性组织比较有显著性差异(t=2.47,P<0.01)。应用Spearman等级相关分析软件处理，相关系数r=0.675，说明Survivin、VEGF与MVD阳性表达强度呈正相关。

　　3 讨论

　　Survivin是1997年耶鲁大学Altier实验室利用效应细胞蛋白酶受体筛选人基因组文库获得的凋亡抑制蛋白〔4〕。具有抑制细胞凋亡和调节细胞分化的双重功能，与肿瘤的发生、发展及预后有密切相关性。Ito等〔5〕用免疫组化方法研究发现20例肝癌组织中14例(70%)有Survivin的阳性表达。最近报道〔6〕Survivin基因还被发现存在于结肠息肉、乳腺炎、角化皮炎等一些癌前损伤组织中，因此检测Survivin在肺癌组织中的表达有助于了解Survivin和肺癌的相互关系。

　　肿瘤血管的形成取决于内皮细胞的生存和凋亡平衡的结果。本研究发现，肺癌组织中MVD明显高于癌旁和肺良性瘤样病变组织，说明肿瘤是典型的血管依赖性病变，血管生成与肿瘤的发生、生长密切相关。本研究还发现NSCLC中Survivin表达显著高于癌旁组织，提示Survivin促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，是一个细胞增殖旺盛的指标，Survivin也参与了血管形成的过程，促进血管内皮细胞增殖，抑制内皮细胞凋亡，使血管增殖旺盛，促进血管生成，在血管形成的中间环节具有重要意义〔7〕。血管生成的过程受肿瘤分泌的多种促进血管生成因子的调节。VEGF是一种高度特异性的有丝分裂原，能直接刺激新生血管的形成;又可诱导血管的通透性和随之而来的纤维蛋白降解，被公认为是最重要和最强的促血管生成因子〔8〕。Survivin作为一种凋亡抑制蛋白，阻止内皮细胞凋亡，是血管形成中生长因子诱导的保护性基因，维持血管内皮细胞的正常增殖，在体内血管形成过程中稳定血管结构。Survivin不仅可以抑制肿瘤细胞的凋亡，而且可抑制肿瘤血管内皮细胞的凋亡。促血管因子VEGF在肿瘤细胞中高表达，不仅直接促进血管的形成，还可诱导Survivin表达，产生抗凋亡作用，引起血管过度增生。因此两者共同作用，促进血管形成并有可能引起肿瘤的转移。本研究表明VEGF的表达与肺癌的发生、发展有关〔9〕，这与Shijubo等〔10〕结论一致。

　　在人类NSCLC组织中，Survivin的高表达提示了该基因可能通过抑制癌细胞凋亡而对肺癌的发生发展起重要作用，至于在癌旁组织中增强表达的Survivin的作用机制与在癌组织中表现的分子机制相同，还是有自己独特的表达机制，仍有待于进一步的研究。分析Survivin和VEGF、MVD三者在NSCLC组织中表达的相互关系及其与肿瘤血管生成的作用，可为肺癌早期诊断、癌变细胞形成和早期癌变细胞逆转提供理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Lu CD,Altieri DC，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene surviving，correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas〔J〕.Cancer Res,1998;58(9):1808-12.

　　2 高 航，姜云鹏，东广华，等.VECF、bFGF及PCNA在宫颈癌中的表达及其与肿瘤增殖和血管生成的关系〔J〕.白求恩医科大学学报，2000;26(3):241-3.

　　3 Weidner N.Intra-tumor microvessel density as a prognostic factor in cancer〔J〕.Am J Pathol，1995;147(1):9-19.

　　4 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene survivin expressed in cancer and lymphoma〔J〕.J Nat Med,1997;3(8):917-21.

　　5 Ito T,Shiraki K,Sugimoto K,et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma〔J〕.J Hepatol,2000;31(5):1080-5.

　　6 Crossman D,McNiff JM，Li F.Expression of the apoptosis inhibitor survivin，in nonmelanoma skin cancer and gene targeting in a keratinocyte cell line〔J〕.Lab Invest,1999;79(9):121-6.

　　7 Mccarthy JS，Tannock IF，Degendorfer P.A phase Ⅱ trial of docetaxel and cisplatin in patients with recurrent or metastaic nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2002;38(7):686-90.

　　8 Ikeda N，Nakajima Y，Sho M,et al.The association of kappa-ras gene mutation and vascular endothelial growth factor gene expression in pancreatic carcinoma〔J〕.Cancer,2001;92(3):488.

　　9 许 茜，彰俊杰.肺癌血管内皮生长因子的表达及意义〔J〕.国外医学·生理病理科学与临床分册,2002;22(2):128-9.

　　10 Shijubo N，Uede T，Kon S,et al.Vascular endothelial growth factor and osteopontin in stage I lung adenocarcinoma〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，1999;160(4)：1269-73.