IL10对TGFβ刺激成纤维细胞转化的影响

　　作者：姚鲁肃 吕长俊 王晓芝 钱知勉 作者单位：滨州医学院附属医院呼吸科 滨州市 256603

　　【摘要】 目的 探讨白介素10(interleukin10,IL10)对转化生长因子β(transtorm growth factor beta,TGFβ)刺激成纤维细胞增殖、胶原分泌以及向肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)转化的影响。方法 培养人胚肺成纤维细胞，根据不同的处理方法分为五组：A组加入TGFβ (5 ng/ml)，B组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(5 ng/ml)，C组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(15 ng/ml)，D组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(25 ng/ml)，E组为空白对照组(无细胞)。于72　h使用MTT方法观察各组成纤维细胞增殖情况，羟脯氨酸消化法检测胶原产生量，免疫细胞化学法检测平滑肌肌动蛋白( αsmooth muscle actin,αSMA)的表达情况。结果 B、C、D组细胞内αSMA表达量分别与A组比较，差异均有统计学意义(P均<0.01)，D组与B、C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01);羟脯氨酸产生量C与B组、D组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。细胞增殖吸光度D组与C、B组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 在体外IL10对TGFβ刺激成纤维细胞的增殖、胶原产生及αSMA表达有抑制作用，且呈剂量依赖性。

　　【关键词】 白细胞介素10; 成纤维细胞;平滑肌肌动蛋白

　　Effects of IL10 on TGFβ induced transdifferentiation of fibroblasts

　　YAO Lusu Lü Changjun WANG Xiaozhi et al

　　Department of Respirology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of IL10 on TGFβ induced transdifferentiation of fibroblasts, multiplications and generation of collagen.Methods Human embryo lung fibroblasts were divided into 5 groups according to different treatment. Group A:treated with TGFβ at the concentrations of 5 ng/ml, Group B:treated with TGFβ at the concentrations of 5 ng/ml and IL10 at the concentrations of 5 ng/ml, Group C:treated with TGFβ at the concentrations of 5 ng/ml and IL10 at the concentrations of 15 ng/ml,Group C:treat with TGFβ at the concentrations of 5 ng/ml and IL10 at the concentrations of 25 ng/ml,Group E:control group，culture dishes not containing fibroblasts.After 72 hour, MTT evaluated the situation of cell multiplication, hydroxyproline digestion examination detected the collagen generation and αSMA expression examinated by immunocytochemistry.Results The αSMA expression of fibroblasts in group B,group C,group D was significantly higher than that in group A(all P<0.01), the αSMA expression in group C was higher than that in group B(P<0.05) and significantly lower than that in group D(P<0.01). There were sifnificant differences in the collagen generation of fibroblasts between group B,group C,group D(all P<0.01).The cell multiplication of group C was higher than that of group B(P<0.05) and significantly lower than that of group D(P<0.01). Conclution Different concentrations of IL10 can reduce cell multiplication,collagen formation and αSMA expression of fibroblast stimulated by TGFβ in vitro, its inhibitory effect depends on concentration.

　　【Key words】 interleukin10, fibroblasts,αsmooth muscle actin

　　肺纤维化为弥漫性肺间质性疾病的共同结局，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度生成及异常沉积是其共同的病理学特征。成纤维细胞特别是其分化所成的以胞浆内含有平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,αSMA)为特征的肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)，可持续分泌大量ECM [1]。TGFβ(transtorm growth factor beta,TGFβ)作为公认的促纤维化因子在MFB分化过程中起着重要作用，以往研究发现IL10可在体内减弱TGFβ的促纤维化作用[2]。本实验通过IL10干预TGFβ作用后的成纤维细胞，观察IL10是否可影响TGFβ刺激成纤维细胞转分化作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 细胞：①人胚肺成纤维细胞株:重庆第三军医大学生物实验室;羟脯氨酸检测试剂盒：北京中杉生物公司;②重组人TGFβ、重组人IL10：Peprotech公司;③单克隆鼠抗平滑肌肌动蛋白抗体、羊抗鼠二抗：武汉博士得生物工程有限公司。④胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培养液：杭州四季青生物公司。

　　1.2 方法 人胚肺成纤维细胞复苏后，置入5%CO2、37℃培养箱中进行培养，培养瓶内细胞生长达80%左右时，以0.1%胰酶消化传代，选择第3、4代细胞用于下述实验。

　　1.2.1 IL10对成纤维细胞增殖的影响:细胞经胰酶消化后，以6×104/ml浓度，每孔取200 μl加入96孔板中，纵向取5组(每组12孔)。A组：加入TGFβ (5 ng/ml);B组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(5 ng/ml);C组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(15 ng/ml);D组加TGFβ (5 ng/ml)+IL10(25 ng/ml);E组：空白对照组(孔板内无细胞)[3]。干预前换无血清培养基培养细胞12 h，使细胞处于静止状态。于加入试剂后72 h取出96孔板，每孔加入20 μl MTT(5 ng/ml，用无血清RPMI 1640配制，过滤除菌)，继续培养4 h。吸去培养液，加入0.2 ml DMSO,震荡5 min，继续培养30 min。在波长570 nm处测定吸光度。

　　1.2.2 羟脯氨酸消化法检测胶原：细胞经胰酶消化后，加6孔板中，分组及干预方法同上。于加入试剂后72 h终止作用，收集细胞上清液0.25 ml于测定管中，空白管和标准管中分别加0.25 ml双蒸水和标准液。三个管中分别加0.05 ml的消化液，再分别加入羟脯氨酸检测试剂盒中试剂一0.5 ml，混匀，室温静止10 min，分别加入试剂二0.5 ml，混匀，室温静置5 min，分别加入试剂三1.0 ml，混匀，60 ℃水浴15 min，流失冷却后，3 500 r/min离心10 min，取上清在550 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。羟脯氨酸量=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)乘以标准管浓度。

　　1.2.3 IL10对成纤维细胞转化的影响:细胞消化计数后接种于底部放置盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁后换成无血清培养基培养12 h。分组及干预方法同上。于加入试剂后72 h终止作用，收取盖玻片，洗涤、固定细胞，行 αSMA蛋白免疫细胞化学染色(按试剂说明书)，用二氨基苯联胺(DAB)显色。采用病理图像分析系统分析，随机选择4个视野，以其平均积分吸光度(A)值作为αSMA的相对含量[4]。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件处理数据，结果以x±s表示，数据处理运用方差分析、组间均数进行Dunnettt检验及SNKq检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 IL10对TGFβ刺激成纤维细胞增殖的影响 B组吸光值与A组比较差异有统计学意义(P均<0.05);C、D组分别与A组比较，均有统计学意义(P均<0.01);D组与B组、C组比较差异也均有统计学意义(P<0.01)，且随IL10浓度的升高而增加(表1，图1～3)。

　　2.2 IL10对TGFβ刺激成纤维细胞胶原产生的影响 B组与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)，C、D组分别与A组比较，均有统计学意义(P均<0.01);C、D组与B组比较差异有统计学意义(P<0.01)，D组与C组比较差异有统计学意义(P均<0.01)，且随IL10浓度的升高而增加(表1)。

　　2.3 IL10对TGFβ刺激成纤维细胞转化的影响 图像分析显示，B、C、D组细胞内αSMA表达量分别与A组比较，差异均有统计学意义(P均<0.01)，D组与B、C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)，且随IL10浓度的升高而增加(表1)。

　　表1 72 h不同浓度IL10对TGFβ促纤维化作用的影响组别 细胞增殖

　　(吸光度)羟脯氨基酸产生量

　　(μg/ml)αSMA值　 A组 0.877±0.067 0.554±0.037 0.501±0.050B组 0.732±0.076**0.496±0.042**0.386±0.043*C组 0.644±0.061* 0.421±0.030*# 0.328±0.035*D组 0.597±0.056* 0.373±0.043*#△0.253±0.038*#△F值 16.4 12.7 20.5P <0.01 <0.01 <0.01 注：B、C、D组与A组比较，*P<0.01，**P<0.05;C、D组与B组比较，#P<0.01;D与C组比较,△P<0.01

　　图1 A组细胞内SMA免疫组化染色见胞浆内有

　　棕褐色细丝状着色(×400)

　　图2 B组细胞内SMA免疫组化染色见胞浆内有

　　棕褐色细丝状着色，但较A组浅(×400)

　　图3 D组细胞内SMA免疫组化染色见胞浆内有棕褐

　　色细丝状着色，但较A、B组浅(×400)

　　3 讨论

　　肺间质疾病是一组发病原因不明的纤维化性肺疾病，在各种致病因素导致肺部早期炎性病变过程中，炎性细胞释放多种活性因子，激活静息状态的成纤维细胞转化为平滑肌肌动蛋白(MFB)。大量MFB聚集在肺纤维化病灶中持续产生分泌细胞外基质(ECM)，造成大量ECM的过度异常沉积，导致肺组织病理性重塑，顺应性降低。TGFβ是目前已知的在MFB转化过程中发挥重要作用的诱导因子，其可在体外诱导肺、肝、肾、眼眶等多种组织器官中成纤维细胞的增殖、分化[1]。

　　IL6、IL7、Thy1、IL10等多种细胞因子均可拮抗TGFβ的致纤维化作用[5]。已有发现，对TGFβ作用后的小鼠转导IL10基因后，I型胶原分泌量及纤维化程度均较对照组有明显改善，肺泡巨噬细胞内TGFβ水平明显降低[6]。我们观察到IL10在体外减少TGFβ诱导αSMA在人胚肺成纤维细胞的表达以及胶原的产生，结果与国外文献一致。

　　IL10在体内主要由巨噬细胞、I型肺泡上皮细胞及多种炎性细胞分泌，为一种免疫抑制因子，具有抗炎、抗氧化作用，而在纤维化过程中所发挥的作用机制尚不清楚。研究发现，特发性肺纤维化(IPF)患者肺泡巨噬细胞内IL10含量明显降低[7]。当小鼠暴露于射线照射，以及吸入二氧化硅粉尘、内毒素之后，早期肺组织巨噬细胞、中性粒细胞内IL10含量有所增加，但是随着暴露延长及至后期出现纤维化时，其含量逐渐降低，与纤维化的进展程度呈负相关。对肺纤维化模型小鼠注射干扰素后，肺泡巨噬细胞及成纤维细胞IL10分泌水平显著提高，同时肺纤维化进展速度减慢[8]。本研究提示，IL10可在体外抑制TGFβ诱导肺成纤维细胞向MFB的转化，降低细胞增殖水平及胶原产生量，该抑制作用呈剂量依赖性。依据实验结果，我们推测IL10可通过抑制TGFβ对成纤维细胞的刺激，而发挥其减弱、改善肺纤维化程度的生物学活性。

　　【参考文献】

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　　[6] Nakagome K, Dohi M, Okunishi K,et al.In vivo IL10 gene delivery attenuates bleomycin induced pulmonary fibrosis by inhibiting the production and activation of TGFβ in the lung[J].Thorax,2006,61(10):835836.

　　[7] Freeburn RW, Armstrong L, Millar AB,et al.Cultured alveolar macrophages from patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) show dysregulation of lipopolysaccharideinduced tumor necrosis factoralpha (TNFβ alpha) and interleukin10 (IL10) inductions[J].Eur Cytokine Netw,2005, 16(1):516.

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