人胚肺间充质干细胞对放射性肺炎肺组织损伤的修复作用

　　作者：刘伟 李晓辕 彭丽萍 作者单位：吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 研究人胚肺间充质干细胞(MSC)对放射性肺炎肺组织的修复作用。方法 取3～5个月的流产胎儿，按照人骨髓MSC的体外培养方法，获得贴壁的人胚肺细胞，观察其形态、细胞周期和体外诱导分化潜能。通过培养放射性肺炎肺泡上皮细胞，利用细胞培养技术体外测定人胚肺MSC修复放射损伤肺组织的能力，对比检测实验及对照组TGFβ1的含量。结果 人胚肺MSC可在体外扩增培养，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于G0/G1期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点。其免疫表型与骨髓来源的MSC相似，并能有效调控放射性损伤后的肺泡上皮的生长。结论 人胚肺MSC能有效修促进肺泡上皮细胞的生长，且能对放射性损伤后肺上皮细胞进行修复。

　　【关键词】 人胚胎肺;间充质干细胞; 放射性肺炎

　　放射性肺损伤是最为常见和严重的胸部放疗并发症之一，其高发病率限制了肿瘤的放疗剂量，从而使肿瘤治疗疗效下降，部分重度放射性肺损伤明显增加了患者的死亡风险。因此积极寻找能够预防、逆转和治疗放射性肺损伤并且副作用小的治疗方法成为非常重要的课题。人们在许多组织和器官中都发现和分离了具有多分化潜能的相应干细胞，但在肺组织证实和分离肺干细胞的研究进展缓慢，呼吸道黏膜上皮及肺泡上皮细胞终生不断自我更新，尤其在肺组织严重损伤以后，上皮更新，促进创伤修复，在理论上肯定存在多能干细胞，人们用同位素标记的方法取得了一些肺干细胞存在的证据，肺泡上皮Ⅱ型细胞中可能存在具有干细胞特征的细胞类型。本研究通过对人胚肺MSC分离、传代培养、生物学特性及多向分化能力的测定，明确了人胚肺MSC的干细胞特性。通过动物体内实验及体外细胞培养试验，证实了人胚肺MSC能有效促进肺泡上皮细胞的生长，且能对放射性损伤后肺上皮细胞进行修复〔1，2〕。

　　1 材料与方法

　　1.1 MSC的分离和培养 选取15例水囊引产胎儿，胎龄为3～5个月。取胎儿肺脏，用DHanks液反复冲洗，剪成碎块，用0.2% Ⅱ型胶原酶(Sigma)消化，37℃、30 min，过100目钢网，制成单细胞悬液，细胞密度为2×106/ml，用含DMEM/F12，MCDB201，2% FCS(Gibco BRL公司)培养液，置37℃，5% CO2培养箱培养，3 d后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达80%～90%融合时，0.25%胰酶(Sigma)常规消化传代。

　　1.2 细胞形态学观察及细胞周期的测定

　　1.2.1 细胞形态学观察 取1～7代MSC，置于有小玻片的3.5cm直径平皿中，37℃，饱和湿度，5% CO2培养12 d后取出，空气风干，瑞士染色，油镜下观察细胞形态。

　　1.2.2 细胞周期的测定 MSC细胞周期分析的主要试剂：RNA酶I(TaKaRa)，碘化丙啶(PI，Sigma)。将胎儿MSC消化，70%冷乙醇4℃固定30 min，PBS液洗涤细胞2遍，5 μg/ml I染色(室温，5 min)，用流式细胞仪(FACSVantage型)检测，Mod FIT软件分析结果。用流式细胞仪测定第11、15代MSC的DNA含量，可见处于G0/G1期的细胞多，分别为95.34%、95.68%，S期少，分别为4.13%、3.58%。

　　1.3 免疫组化及PTPCR方法检测人胚肺MSC向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化能力

　　1.3.1 人胚肺MSC的一般生物学特性 单个核细胞培养48～72 h后，在镜下可见散在的贴壁细胞，呈典型纺锤样成纤维细胞状，7～10 d形成放射状克隆，挑出20个克隆分别培养，约1 w形成致密的贴壁细胞层，细胞形态均一，生长速度快，易被胰酶消化，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变。以下描述中将此类细胞称为人胚肺贴壁细胞(fetal lungderived adherent cell，FLAC)，见图1。

　　1.3.2 MSC多系诱导分化的鉴定 FLAC在成脂肪诱导体系中培养3 d，细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短，成为立方形或多角形。连续培养7 d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合。培养2 w时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，诱导2周期后用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异的染成红色，见图2B。上述细胞同时表达脂肪细胞特异性的PPARγ2。成骨培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照中细胞仍是梭形且呈单层生长;80%～90%的细胞呈Apase阳性，而对照中的Apase阳性细胞较少;von Kossa染色发现在成骨培养有明显的钙化基质沉积，而对照中未见到此现象;RTPCR分析表明MSC经OS诱导分化培养后表达骨钙蛋白基因，见图2C。

　　1.4 放射性肺炎肺泡上皮细胞的培养 2BS细胞条件培养液的获取：(1)条件培养基1的制备：2BS细胞培养至当细胞生长融合达90%时，给予换液，24 h后无菌条件下取其上清，过滤细胞碎片后备用。(2)条件培养基2的制备：2BS细胞培养至当细胞生长融合达90%时，给予换液，同时取C57BL/6小鼠全肺用6MVX线直线加速器进行单次照射13 Gy后单个肺细胞进行共培养，24 h后取上清，过滤细胞碎片后备用。

　　1.5 细胞培养技术体外测定人胚肺MSC修复放射损伤肺组织的能力，对比检测实验及对照组TGFβ1的含量

　　1.5.1 实验动物和饲养环境 健康雌性 C57BL/6 小鼠40只，体重(200±20)g，由上海实验动物研究中心提供，饲养于SPF级大鼠饲养室，受试前笼养7 d以适应环境。

　　1.5.2 试剂及仪器 大鼠转化生长因子β1(TGFβ1)ELISA试剂盒，为博士德公司产品。SIEMENS PRIMUS KP2型直线加速器由德国西门子公司生产。

　　1.5.3 动物分组 在照射前1 w将40只雌性，C57BL/6 小鼠,随机分作随机分为空白组、模型组、实验组1，实验组2，每组动物均为10只。

　　1.5.4 模型建立及实验方法 空白组：不做任何处理;其余3组均用6MVX线直线加速器进行全肺单次照射13 Gy;实验组1照射后每3日给予尾静脉注射条件培养液1约0.3 ml;实验组2照射后每3日给予尾静脉注射条件培养液2约0.3 ml。

　　1.5.5 标本收集及处理 照射后4 w，每组各随机取5只小鼠活体取材。腹腔注射2%戊巴比妥钠0.12 ml/100 g，将大鼠麻醉后，分别取4 ml腹主动脉血用ELISA方法检测血清中TGFβ1的水平;将右上肺组织固定于10%缓冲性甲醛液中，常规制成石蜡切片备用，HE染色后光镜观察病理改变。

　　2 结 果

　　2.1 光镜下观察组织病理改变 与空白组小鼠比较，模型组小鼠的肺组织照射后存在明显的病理组织学改变，早期以急性炎症反应为主，表现为肺充血、水肿、肺间质增厚，见图3A;实验组1的病理与单纯照射组小鼠相似，存在明显的炎症反应，肺充血、水肿明显，且肺泡腔内可见明显渗出液，提示炎症反应较重，见图3B。实验组2的病理表现则与正常组小鼠接近，炎症反应较轻，仅表现为轻度肺充血，见图3C。

　　2.2 照射后各组大鼠血清TGFβ1水平 照射后4 w开始，实验组1及模型组小鼠血清TGFβ1浓度明显增高〔(30.25±6.33) ng/ml vs (16.95±2.47) ng/ml〕，实验组1尤为明显(P<0.05)，实验组2与空白组小鼠血清TGFβ1浓度相接近〔(11.50±2.82) ng/ml vs (10.12±1.83) ng/ml〕，与空白组相比，实验组2小鼠血清TGFβ1浓度明显减低(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　现阶段研究表明，放射性肺炎所致的肺组织损伤不仅仅是单一靶细胞损伤的结果，而且是一个有多种细胞参与、有多种细胞因子调控的复杂过程〔3〕。放射线致使肺泡Ⅱ型细胞和血管内皮细胞受损〔4〕，急性期表现为肺血管特别是毛细血管损伤，产生充血、水肿和细胞浸润，急性改变有可能自行消散，但常引起肺结缔组织增生和纤维化。其中肺组织病理改变是反映肺炎程度的最直观指标，可判断肺炎的程度,同时也可以筛选预防与治疗的药物。基础研究发现，放射性肺损伤可引起肺内效应细胞即肺泡巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞释放多种细胞因子,介导炎性反应，启动和促进肺组织纤维化。其中TGFβ1较为重要，是诸多参与放射性肺损伤因子中颇受关注的细胞因子，能够将生物效应扩大，参与放射性肺损伤的发生与发展〔4〕。

　　近年来,干细胞的研究引起了人们的极大关注,而成体干细胞的可塑性研究是干细胞研究领域的热点之一,其中发现最早并且研究最多的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)。BMSCs是来源于中胚层的一类多能干细胞,在不同诱导条件下具有向心肌细胞、肝细胞、神经元及肺泡上皮细胞等分化的多项潜能〔5～7〕。BMSCs可取自自体骨髓,取材方便且体外易于分离培养,对机体损伤小,免疫原性弱,组织相容性好,这为移植BMSCs替代治疗受损组织提供了可能。

　　放射性肺炎与多种细胞、生长因子的激活和相互作用有关。有文献报道〔8〕，小鼠肺部接受照射后1 d，肺组织中即可出现TGFβ基因和Ⅰ型胶原基因的表达增多;照射后14 d，其表达量为第1天的5倍。研究表明，发生放射性肺损伤患者的血清TGFβ1含量也持续升高〔9〕，提示血清TGFβ1可作为放射性肺损伤的预测因子，并且可通过降低血清TGFβ1浓度来减轻肺组织的损伤。本实验显示，在照射后初期，小鼠血清TGFβ1浓度就显著增高，而人胚肺MSC却能使血清TGFβ1浓度持续下降，起到减轻放射性肺炎的作用。本研究发现放射性肺炎是在各种靶细胞和TGFβ1等细胞因子的共同作用下相互影响、相互调节的。人胚肺MSC可能通过下调TGFβ1的表达对急性放射性肺炎起到一定的防治作用，可为临床提供有关放射性肺炎治疗的新的生物治疗方法。

　　【参考文献】

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　　3 韩 光,周福祥,周云峰.放射性肺损伤的研究〔J〕.国外医学·放射医学核医学分册，2005;29(6)：2826.

　　4 白蕴红,王德文,杨 怡,等.Ⅱ型肺泡上皮细胞在大鼠放射性肺损伤中的变化〔J〕.军事医学科学院院刊,1995;19(3)：2002.

　　5 Orlic D,Kajstura J，Chimenti S,et al.l Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium〔J〕.Nature，2001;410(6)：7015.

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　　7 Rupp S，Badorff C,Koyanagi M,et al.Statin therapy in patients with coronary artery disease improves the impaired endothelial progenitor cell differentiation into cardiomyogenic cells〔J〕.Basic Res Cardiol，2004;99(1)：618.

　　8 Finkestein JN,Johnston CT,Baggs R,et al.Early alterations in extracellular matrix and transforming growth factor β1 gene expression in mouse lung indicative of late radiation fibrosis〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994;28(3)：621.

　　9 NovakovaJiresova A,van Gameren MM,Coppes RP,et al.Transforming growth factorbeta plasma dynamics and postirradiation lung injury in lung cancer patients〔J〕.Radiother Oncol,2004;71(2)：1839.