急性肺缺血再灌注引起肺组织表面活性物质相关蛋白A变化实验研究

　　作者：王海英，倪松石1 许文景2 作者单位：(1南通大学附属医院呼吸内科，南通226001;2苏北第一人民医院)

　　【摘要】 目的：探讨肺急性肺缺血再灌注(ischemia reperfution，I/R)时表面活性物质相关蛋白A(surfactant- associated protein A，SP-A)含量的变化与肺损伤的关系。方法： 40只健康的SD大鼠，雌雄不拘，随机分成5组：假手术组(S)、单纯缺组(I)、再灌注1 h组(R1组)、再灌注2 h组(R2组)、再灌注6 h组(R3组)。根据Eppinger模型建立原位阻断左肺门大鼠温肺I/R模型。术毕测定各组血清丙二醛(MDA)及肺湿/干重比例(W/D)、病理观察、用Western-Blot及免疫组化法检测各组肺组织中SP-A。结果：(1)MDA、肺W/D在I组即较S组开始升高，予再灌注后，各组MDA、肺W/D随再灌注时间的延长明显升高(P<0.05);(2)SP-A在S组表达最多，在I组表达减少，再灌注后随时间的延长表达更少(P<0.05)。结论： 大鼠肺急性I/R后，肺表面活性物质相关蛋白A减少是造成肺一系列损害的重要因素。

　　【关键词】 缺血再灌注;丙二醛;肺湿/干重;肺表面活性物质相关蛋白A

　　The Experimental Research of the change of surfactant- associated protein A Resulting

　　from the Acute Lung Ischemia-reperfution

　　WANG Haiying1, NI Songshi1 , XU Wenjing2 (1Department of respiratory Medicine, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective：We detect the quantity of MDA in serum, the W/D, the quantity of SP-A in the lung tissue, In order to know the change of SP-A and the relation between the SP-A’s alternation and the injury. Methods：Without considering of their sex, 40Health SD rats were chosened and divided into five groups, 8 rats in every group. They were as follows: the rats who received a left anterolateral thoracotomy without clamping the left hilum as Sham group(S)，the rats whose left hilums were clamped for 1 hour without reperfusion as ischemia-only group(I)，the rats whose hilums were clamped for 1 hour and then unclamped for 1, 2, 6 hours as ischemia/reperfusion group (R1, R2, R3). The rat model of warm ischemia and reperfusion in situ in left lung is set up on the basis of Eppinger’s Model. After operation, MDA and lung W/D was detected for every group. The expression of SP-A in the lung tissue of every group was detected by Western-blot and immunohistochemistry. Results：(1)MDA and W/D was increased in I group. In R1, R2, R3 group, MDA and W/D was more as the time passed by. The difference among every group was so significant(P<0.05).(2)the expressing of SP-A was highest in S group; decreased in I group and even litter as the reperfusion time enhanced. Conclusion: The important cause of the lung’s injury was the decrease of the SP-A’s expression.

　　[Key words] Ischemia-reperfusion; Minimum descent altitude;W/D; Surfactant- associated protein A

　　随着肺栓塞溶栓治疗及心脏手术、肺移植、心肺脑复苏措施的深入开展，肺缺血再灌注损伤(ischemia-reperfution injury，IRI)及其所导致的肺功能障碍的发生机制和防治也越来越受到人们重视。大量的研究表明，呼吸困难重要病理生理基础之一是肺表面活性物质(PS)的减少以及由此引起的肺泡萎陷、肺不张等所致肺内血液分流、通气/血流比例失调、弥散障碍。使用PS替代治疗动物实验过程中发现，外源性的PS能减少缺血再灌注过程中SP-A的丢失[1]，且内源性SP-A关键性影响肺移植过程中PS替代治疗的效果[2]。本实验研究急性肺I/R过程中SP-A的变化规律为进一步探讨肺IRI的机制及治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 健康的SD大鼠40只，雌雄不分，体重250~350 g，由南通大学实验动物中心提供。随机分成5组：假手术组(S组)、单纯缺血组(I组)、再灌注1 h(R1组)、再灌注2 h组(R2组)、再灌注6 h组(R3组)，每组8只。根据Eppinger模型建立原位阻断左肺门大鼠温肺I/R注模型。I组单纯缺血1 h，R1组、R2组、R3组均缺血1 h后，分别给予再灌注1、2、6 h。从左心房采血2 ml，2000 r/min离心，取上清-20 ℃保存。处死大鼠，左肺分成3份保存，分别做病理、Western-Blot、免疫组化、称湿/干重。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 血清MDA 的测定 根据MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明进行。

　　1.2.2 肺湿/干重比测定与病理组织学观察 取左下肺组织称湿重后70 ℃电热恒温干燥箱中烤24 h后为干重，计算肺湿/干重量比。并行HE染色病理检测。

　　1.2.3 Western-blot检测 蛋白裂解液提取肺组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制12%的分离胶与5%的浓缩胶。以80 V 20 min及100 V 75 min恒压电流，溴芬兰至分离胶底部0.5 cm时，电泳结束。350 mA 120 min转膜。膜放入5%脱脂奶粉TBST液稀释(1︰500)的兔抗鼠SP-A多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology ，USA)中室温1 h，4 ℃ 8 h;再将膜放入5%脱脂奶粉TBST液稀释(1︰5000)的生物素标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)中，4 ℃ 2 h杂交。再将化学发光剂、增强剂按1︰1混合，在暗室，胶片暴光2 min，取出冲洗，晾干。将胶片暴光结果扫描到计算机，用Scion Image软件进行条带灰度值分析。

　　1.2.4免疫组织化学检测 石蜡切片常规脱蜡至复水3%H2O2去除内源性过氧化氢酶，微波修复抗原，正常非免疫动物血清封闭，加1︰200稀释的一抗同时用PBS作阴性对照，二抗孵育。PBS冲洗，加DAB显色液，苏木素复染封片。

　　1.3 统计学方法 采用Stata 7.0软件进行统计分析，变量以■±s表示，采用方差分析两两比较用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 HE染色 S组大鼠肺组织结构正常;I组仅见肺间质轻度水肿，少量炎症细胞浸润，血管内淤血现象，部分可见肺不张;R1、R2、R3组随时间的推移肺间质水肿逐渐加重，肺泡腔渗出，透明膜形成，并有中性粒细胞浸润和肺组织结构的破坏。

　　2.2 血清MDA及肺W/D变化 见表1。

　　2.3 Western Blot 见图1、2。由图可见，β-action(45 kD)作为内参，各组都有较均一的表达，说明各组蛋白上样量相等。在35 kD附近5组条带表达深浅不一，经图像分析软件分析显示SP-A在S组含量最高，I组含量减少，再灌注后SP-A的含量随再灌注时间的延长更少(P<0.05)。

　　2.4 各组SP-A的变化 光镜下见SP-A表达阳性为棕黄色，分布在肺泡Ⅱ型细胞、Clara细胞及部分巨噬细胞。在S组，可见多个SP-A强阳性的Ⅱ型细胞，部分肺泡腔表面有薄层黄染物质。再灌注组肺泡腔内巨噬细胞增多，部分因吞噬SP-A呈棕黄色。免疫组织化学显示：I组SP-A含量较S组SP-A阳性的Ⅱ型细胞减少;R1、R2、R3组随时间推移SP-A强阳性的Ⅱ型细胞逐渐减少，较I组更明显(图3~7)。

　　3 讨 论

　　既往有动物实验证明结扎肺动脉与肺动脉栓塞产生的病理结果相似[3]。用结扎线结扎或无创血管夹钳夹肺动脉一定时间后剪开结扎线和撤除血管夹恢复血流供应可制成肺IRI模型[4]。

　　SP-A是PS的重要组分之一，可稳定细胞内外PS水平，为自身调节因子[5];参与局部防御功能，具有免疫和抗炎的作用;能促进正常的肺泡巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞，促使肺泡炎症的消退[6];还能增加巨噬细胞内的超氧自由基和NO，促进杀菌作用;还可激活磷脂酰肌醇-3(PI-3K)途径从而抑制肺泡Ⅱ型细胞(AT-Ⅱ)的凋亡[7];最重要的功能之一就是降低肺表面张力，防止肺泡萎陷和肺不张。

　　脂质过氧化指标MDA含量的测定反映机体受氧自由基攻击的程度。MDA在S组最低，I组及再灌注组明显升高，且随再灌注时间的延长升高更明显。肺W/D是检测肺含水量变化的敏感指标，反映肺水肿、特别是肺泡内水肿及微血管的损伤[8]。W/D比重越高说明肺组织损伤越严重。W/D在S组最低，I组及再灌注组明显升高，且随时间延长升高更明显。SP-A在I 组即开始下降，随着灌注时间的延长，SP-A下降更明显，反映了缺血缺氧及再通的情况下SP-A减少持续性。本实验提示，在缺血期即出现SP-A的减少, 且随着再灌注时间延长而明显，这与此期间肺组织形态学改变、W/D、血清MDA的改变趋势是一致的，说明肺SP-A是急性肺IRI的一个指标。

　　急性肺IRI后SP-A减少机制考虑如下：(1)合成减少。与AT-Ⅱ细胞的变性，坏死及凋亡有关; (2)氧自由基、炎症介质(如TNF-α)等使其灭活增加 [9];(3)巨噬细胞吞噬增加，使SPA清除加快 [10];(4)漏入血浆，急性肺I/R时肺泡毛细血管膜通透性增加 。缺血再灌注期间肺W/D逐渐增加，提示肺泡毛细血管损伤加重，通透性增加，漏入血浆增多;(5)消耗增加，肺I/R时由于低氧刺激呼吸中枢使呼吸频率加快，从而使SP-A随呼吸消耗增多。

　　本动物实验研究显示急性I/R过程中存在氧自由基的激活、脂质过氧化、SP-A的减少，并探讨了他们之间的相互关系，为临床进一步认识及预防肺IRI提供理论依据。

　　【参考文献】

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　　[10] Jain D, Dodia C, Fisher AB, et al. Pathways for clearance o surfactant protein A from the lung[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289(6): 1011-1018.