应用激光捕获显微切割技术制备肺癌蛋白质组学研究样品

　　作者：田应选　南岩东　杨拴盈 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科，陕西西安 710004

　　【摘要】目的 探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性。方法 将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8μm冰冻切片，采用改良的HE方法染色;应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞;选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞。结果 通过LCM技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织，得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞。按照Duration 15.5s的激光脉冲频率和平均8000 shots条件，既可保证每个帽子的细胞收集数量，也能够有效地缩短实验时间，提高实验可控性，从而使操作过程标准化。结论 应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞。其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好，是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法。

　　【关键词】 激光捕获显微切割;肺癌组织;蛋白质组学

　　Application of laser capture microdissection to capture pure cells　in lung cancer and their paired normal lung tissues

　　Tian Yingxuan, Nan Yandong, Yang Shuanying

　　(Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective Microheterogeneity is an important problem in molecularly biological and proteomic research on malignancies. The goal of this study was to investigate the method to purify targeted cells in lung cancer and its paired normal tissues for proteomic study on lung cancer applying laser capture microdissection (LCM). Methods LCM technique was emploged to obtain the cells of lung cancer tissues and their paired normal tissues from frozen sections. Results LCM can be applied to quickly and precisely obtain pure targeted cells subgroup or single cell without interstitium under the microscope. Conclusion LCM can tackle the problem of tissue heterogeneity in molecular analysis successfully. These results indicate that LCM has a potential as a tool in lung cancer proteomic research.

　　KEY WORDS: laser capture microdissection; lung cancer tissue; proteomics

　　蛋白质组学是当今肿瘤学研究领域中的一个热点，而“差异”蛋白质组学又是蛋白质组学研究的一个突破口。在有关“差异”的研究中，若原始样品不是分别来自同一类型，或样品存在着杂质蛋白的污染，那么所得实验数据的准确性和说服力必然会受到影响[1]。众所周知，人体组织器官是多种细胞的复合，肿瘤组织的不均一性是肿瘤细胞的重要特征。因此，如何从复杂、不均一的样品中获得理想的高同质性的组分成为实验中亟需解决的主要问题之一。激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)技术的出现为上述问题提供很好的解决方案。该方法的突出特点是能在目视下从样品中特异挑选同类细胞乃至单一细胞;从而剔除间质细胞和坏死组织及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。本研究应用LCM针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞，以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本的收集及制备 收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、陕西省人民医院胸心外科及陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例。正常对照组织为同一患者正常肺组织。12例患者中男性8例，女性4例;有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年;肿瘤分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例(Ⅱ A3例，Ⅱ B4例)、Ⅲ期3例。所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织;4℃冰盐水冲洗3-5次，将血液冲净，均匀分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm组织块，分装于标志清楚的0.5mL离心管中;先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程耗时控制于30min内。

　　1.2 试剂和仪器 苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、尿素等均为国产分析纯。组织包埋剂(OTC)，冰冻切片机(Microm，HM500)，超低温冰箱(Thermo Forma -86℃)，Pixcell显微激光切割系统(Arcturus, USA)及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子细胞收集器(EVA LCM Caps)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 冰冻切片的制备及染色 预处理载玻片(将普通载玻片清洗干净，流水冲洗后泡酸过夜，双蒸水冲洗干净，60℃烘干备用)。取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小组织两块，OTC包埋，待组织包埋固定完全，将切片机箱内温度设置为-25℃进行切片，切片厚度8μm，每次连续制作15张切片，-80℃保存备用。两组肿瘤组织和对照各6例，每例患者制作切片15张，进行HE染色，方法如下：苏木精10s，捞片置于冰水冲洗10s，伊红15s，85%、95%(体积分数)乙醇各20s，无水乙醇2min，2次，二甲苯Ⅰ 2min，二甲苯Ⅱ 2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4-10℃，总时间控制在10min以内。完毕后进行激光捕获。

　　1.3.2 激光捕获 将染色完好切片置于Pixcell显微激光切割系统10×10倍目镜直视观察，重点观察细胞形态和染色情况。找到细胞密集、形态较好、染色满意区域，装载细胞收集器;在10×20倍目镜下调节监视器，按照如下条件：Power 100mV、Duration 15.5s、Spots size 15.5μm、Current 8.0mA，每张切片平均8000 shots条件进行捕获。总捕获时间不超过40min。

　　2 结果

　　切片按照改良的HE方法染色后，均能获得细胞形态完整、对比度好、肿瘤细胞和间质可清楚区分的合格切片。在设定捕获条件下，每张切片捕获后能够将90%以上的细胞收集，细胞同质性高(图1)。按照理论测算，每个shots可以捕获4-6个细胞，即每个帽子收集装置可以获得25000-30000个细胞数。总体捕获结果见表1。

　　表1 不同组织标本显微切割结果(略)

　　Table 1 Effects of microdissection in each group(n=6)

　　图1 激光捕获不同组织细胞及捕获细胞同质性显示(略)

　　Fig.1 Examples of laser capture microdissected in different tissues HE×100

　　A: heterogeneity of cells after microdissection; B: matched normal tissues after microdissection; C: squamous cell carcinoma tissues after microdissection; D: adenocarcinoma tissues after microdissection

　　3 讨论

　　肺脏是一个开放器官，容易受到外界污染，加之肺癌组织含有较多间质细胞而且容易坏死，因此，按照传统方法进行组织块研磨提取总蛋白进行分析，结果难免会受到杂质蛋白的影响。LCM技术现已成为蛋白质组学研究中获得纯化的目的细胞的理想工具，其在实体瘤研究中应用较多，技术方法亦日臻成熟[35]。但据文献报道，该方法主要用于核酸分子以及染色体研究，在肺癌组织蛋白组学研究领域鲜见[6]。本研究应用LCM技术切割不同类型肺癌组织，获得250个帽子收集装置和8.7×106个细胞数。从捕获操作过程中我们发现，捕获细胞的同质性、细胞收集率以及操作过程所耗费时间是影响激光捕获及后续蛋白质组学实验结果的关键因素。由于LCM是在直视下操作，细胞纯度可以保证。经随机抽取3组、45个帽子收集装置，使用Pixcell II显微激光切割系统内标记尺划分观察视野，抽样估算收集装置内细胞同质性可达到95%以上，该结果与文献报道一致[7]。当然，文献报道最多的是关于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCM切割部分是相同的。Pixcell II显微激光切割系统是新一代系统，该系统的优点是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(ethylene vinyl acetate caps, EVA caps)细胞收集装置，可避免操作者手接触所收集到的细胞，减少污染机会。EVA膜需要和细胞紧密接触才能够被激光束融化而将目标细胞收集，因而LCM过程受很多因素影响而不能保证将每个捕获细胞均能收集。激光捕获仪主要参数有：Power、Duration、Spot size、Repeat及Current等。一般在打开系统进行切割之前，应先在帽子空白区空打5-6次，观察激光能量，光点大小是否合适，以光点能够完全覆盖目标细胞为宜。本实验中所选择条件是：Power 100mW、Duration 15.5ms、Spot size 7.5-15μm、Repeat 0.2s、Current 8.0mA。Zhukov等[8]应用LCM切割肺癌组织时认为，鳞癌可选择7.5μm激光束，腺癌中用15μm，可获得较好效果。在本实验中，我们发现激光束的大小与鳞癌和腺癌组织类型关系不明显，但与切片的制作和捕获操作过程关系较大，切片的厚度、脱水时间和EVA膜是否和细胞紧密接触是重要影响因素。制作切片时应将切片厚度控制于8-9μm，以8μm效果最佳，超过10μm因切片过厚则细胞发生重叠从而使细胞收集困难，同时要注意不能使切片产生褶皱，造成切片表面与EVA膜之间存在缝隙，影响捕获效果。在HE染色步骤中，二甲苯疏松时间、组织含水量及环境湿度等均可影响捕获结果。二甲苯疏松时间不足细胞较难从周围组织分离。对环境湿度和组织含水较多者应及时更换染液，适当延长乙醇的脱水时间。但过分延长脱水时间则使组织变的干燥松脆，出现帽子与切片不能紧密接触而无法捕获。在实验过程中梯度乙醇的最长脱水时间为2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(EVA caps)应置于4-10℃、干燥环境妥善保存。如帽子受潮，则激光激发能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子与组织接触局部温度升高，产生组织和捕获细胞灼伤。从肿瘤组织类型看，腺癌的捕获收集成功率最高，可以达到91%;鳞癌相对较差，可能与鳞癌多有癌巢及角化珠形成、癌细胞与间质结合较为致密有关。考虑到正常肺泡及支气管上皮细胞体积相对较小、细胞分布相对稀疏，故正常对照组应多捕获约10个帽子，以保证病例和对照之间可溶性蛋白总量的均衡性。在所有蛋白质组学实验中，标本处理时间都是有严格要求的[9]。一般认为，组织标本超过30-40min常温暴露往往造成细胞内蛋白质大量降解而影响检测结果。在本实验中，我们使用改良的HE染色方法，较标准方法时间缩短14min，明显减少组织暴露时间。但从染色效果看，该方法对细胞核染色效果不佳、核浆的对比度较差;而且在腺癌染色效果与鳞癌和正常组织有所不同，其原因有待深入研究。有学者在乳腺癌等实体瘤标本中使用苏木精单染，其染色时间在30s[10]。我们在预实验中使用该方法发现，尽管用苏木精染色后时间可缩短，避免蛋白质降解，但随着捕获时间的延长，切片染色加深，导致细胞和间质不能很好区分，影响捕获效果。在LCM操作过程中将捕获时间控制在40min内，按照统一标准：Duration 15.5s的激光脉冲频率和平均8000 shots计算，既可保证每个帽子的细胞收集数量，也能够将实验时间尽可能缩短，从而使实验可控性提高使操作过程标准化。当然，从质谱分析的角度出发，通过LCM获取细胞的数量较小是该方法不可避免的缺陷[11]。因此，在后续实验中，选择适当的质谱方法应当慎重考虑。

　　【参考文献】

　　[1]Posadas EM, Simpkins F, Liotta LA, et al. Proteomic analysis for the early detection and rational treatment of cancerrealistic hope? [J]. Ann Oncol, 2005, 16:1622.

　　[2]EmmertBuck MR, Bonner RF, Smith PD, et al. Laser capture microdissection [J]. Science, 1996, 274(5289):9981001.

　　[3]阎峰,李宗芳.激光捕获显微切割技术应用研究新进展 [J]. 癌症, 2004, 23(7):860864.

　　[4]Chen JZ, Gokden N, Greene GF, et al. Extensive somatic mitochondrial mutations in primary prostate cancer using laser capture microdissection [J]. Cancer Res, 2002, 62(1):64706474.

　　[5]田英芳, 刘勇, 张蓬勃.激光捕获显微切割技术及其在脑研究中的应用 [J]. 解剖科学进展, 2005, 11(2):170173.

　　[6]Craven RA, Totty N, Hamden P, et al Laser capture microdissection and towdimensional polyacrylamide gel electrophoresis [J]. Am J Pathol, 2002, 160(3):815822.

　　[7]Segal JP, Stallings NR, Lee CE, et al. Use of lasercapture microdissection for the identification of marker genes for the ventromedial hypothalamic nucleus [J]. J Neurosci, 2005, 25(16):41814188.

　　[8]Zhukov AT, Johanson RA, Alan B, et al. Discovery of distinct protein profiles specific for lung tumors and premalignant lung lesions by SELDI mass spectrometry [J]. Lung Cancer, 2003, 40:267279.

　　[9]Craven RA, Banks RE. Laser capture microdissection and proteomics: Possibilities and limitation [J]. Proteomics, 2001, 1:12001204.

　　[10]Bertucci F, Birnbaum D, Goncalvey A, et al. Proteomics of breast cancer: principles and potential clinical applications [J]. Mol Cell Proteomics, 2006, 5(10):17721786.

　　[11]Guo JZ, Colgan TJ, Desouza LV, et al. Direct analysis of laser capture microdissection endometrial carcinoma and epithelium by matrixassisted laser desorption mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19(6):27622766.