AQP4在COPD支气管黏膜的表达及其与患者肺功能、气道黏膜炎症的相关性

　　作者：孙忠民，朱柏，杨岚，党晓敏，姚艳，陈天君 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院呼吸内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 通过免疫组化法检测支气管黏膜中水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的表达，观察正常组和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)组支气管黏膜中AQP4表达与气道黏膜炎症及肺功能的关系，明确AQP4在COPD发生、发展中的作用，为COPD的防治开辟新途径。方法 选择正常人和COPD患者各30例，测试肺功能，并行支气管镜检查，取得支气管黏膜标本，用免疫组化法检测AQP4表达，HE染色观察支气管黏膜炎症细胞浸润程度。结果 COPD组较对照组AQP4表达减弱有极显著差异(P<0.001)。AQP4表达和FEV1/FVC、FEV1/pred%呈正相关(P<0.001)，与支气管黏膜炎症严重程度呈负相关(P<0.001)。结论 COPD患者AQP4表达减少可能是其肺功能下降及气道炎症加重的原因之一。临床上可以通过改善AQP4治疗COPD。

　　【关键词】 慢性阻塞性肺疾病;水通道蛋白;肺功能;炎症

　　基金项目：陕西省卫生厅基金资助项目(No.2004 D38)

　　Effect of AQP4 expression on chronic obstructive pulmonary disease

　　Sun Zhongmin, Zhu Bo, Yang Lan, Dang Xiaomin, Yao Yan, Chen Tianjun

　　Department of Pulmonary Diseases, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To identify the role of aquaporin-4 (AQP4) in the occurrence and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by observing the relationship between AQP4 expression in mucosa membrane and lung function and the inflammation of mucosa membrane in control and COPD groups. Methods Altogether 30 healthy people and 30 COPD patients were tested in lung function and specimens of mucosa membrane were obtained by bronchoscopic examination. AQP4 expression was tested by immunohistochemistry technique. Results The relationship of the expression of AQP4 with FEV1/FVC and FEV1/pred% was significantly positive.The relationship between the expression of AQP4 and the severity of mucosa membrane inflammation was negatively correlated (P<0.001). Conclusion Decreased AQP4 expression in COPD patients may be one of the causes of weakened lung function and worsened air tube inflammation. Therefore, clinically, increasing the expression of AQP4 may be one of the methods to treat COPD.

　　KEY WORDS: chronic obstructive pulmonary disease (COPD); aquaporin; lung function; inflammation

　　慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。目前，认为COPD是肺部炎症[2]、蛋白酶抗蛋白酶失衡[3]及氧化抗氧化失衡[4]机制共同作用的结果，然而气道湿化作用减低也是COPD发生、发展不容忽视的重要因素。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　COPD组：符合诊断标准的COPD患者30例。年龄35-71岁，平均(55.93±12.53)岁。其中男性20例，女性10例。除外合并其他严重心肺疾病不能耐受气管镜检查者及呼吸衰竭者。对照组：非COPD和急、慢性心肺疾病者，30例，年龄25-73岁，平均(53.42±11.33)岁。其中男性18例，女性12例。

　　1.2 肺功能检查

　　休息5-10 min后，使用德国耶格公司JAEGER肺功仪作肺功能检查，主要测量用力呼气肺活量(FVC)，第一秒呼气容积(FEV1)，一秒率(FEV1/FVC)和第一秒呼气容积占预计值的百分比(FEV1/pred%)等指标。

　　1.3 气管镜检查及标本收集

　　各组在10 g/L(1%)的卡因表面麻醉及20 g/L(2%)利多卡因环甲膜穿刺麻醉后行气管镜检查。钳取黏膜组织，放于10%(体积分数)的甲醛溶液中固定，制成蜡块标本。

　　1.4 实验检测

　　1.4.1 仪器、试剂

　　YJ-875S超净工作台(苏州净化设备公司)，JAEGER肺功能仪(德国耶格公司)，光学显微镜及BH-2显微照相系统(日本Olympus);AQP4兔抗鼠抗体(美国adi公司)，生物素标记羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.4.2 免疫组化方法检测AQP4的表达

　　切片脱蜡，梯度酒精水化后，在蒸馏水中漂洗5 min;用TBS(pH 7.6)冲洗5 min×3次;加3%(体积分数)过氧化氢，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min，PBS(pH 7.4)冲洗5 min×3次;加5%(体积分数)羊血清，室温下孵育10 min，倾去，不冲洗;加1∶50的第一抗体，4 ℃冰箱过夜，空白对照加TBS;PBS冲洗3 min×3次;加50 μL 1∶100生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次;加50 μL 1∶100辣根酶标记的链霉卵白素，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次;DAB显色，脱水、透明、封片。

　　1.4.3 HE染色显微镜下计数炎性细胞

　　切片脱蜡，梯度酒精水化后，在蒸馏水中漂洗5 min;入Gill改良苏木素液10 min;盐酸酒精分化3 s，饱和碳酸锂水溶液中返蓝30 s，加80%(体积分数)乙醇1 min，5 g/L伊红乙醇1 min;脱水，石炭酸二甲苯混合液透明和吸水1 min，再经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各1 min洗净石碳酸，透明、封片。

　　1.5 结果判定

　　1.5.1 HE染色

　　无炎性细胞(-)，炎性细胞散在分布(+)，局灶性分布(),弥漫分布()(图1)。

　　1.5.2 免疫组化染色

　　染色强度以多数细胞为准，染色阴性为(-)，染色呈淡棕黄色为(+)，深棕黄色为()，深棕褐色为()(图2)。

　　1.6 统计学分析

　　数值资料以均数±标准差( ±s)表示。对照组和COPD组的AQP4蛋白表达分析用两独立样本的t检验，两样本等级资料比较用Mann-Whitney Test ，AQP4表达与肺功能的关系，计算spearman相关系数。检验水准为α=0.01。

　　2 结 果

　　2.1 HE染色及AQP4免疫组织化学染色

　　正常支气管黏膜及黏膜下结构完整，黏膜上皮细胞排列整齐，纤毛完整，纤毛上皮间散在杯状上皮细胞，黏膜下层无增厚，可见黏液腺及小血管，平滑肌正常排列。黏膜全层未见炎性细胞浸润(图1A)。当炎症发生时，支气管黏膜柱状上皮细胞纤毛粘连、倒伏、脱失，上皮细胞空泡变性、增生及鳞状化生。杯状细胞和黏液腺肥大、增生，黏膜下层平滑肌萎缩、断裂;随炎症程度不同，炎性细胞在黏膜全层呈散在、灶状及弥漫性浸润(图1B、C、D)。AQP4染色为浅黄到棕褐色不等，在纤毛柱状上皮细胞基侧膜及纤毛管着色(图2)。COPD组比对照组AQP4表达降低，有极显著差异(P<0.001，表1)。表1 COPD组和对照组AQP4表达的比较(略)

　　2.2 肺功能检测

　　COPD组比对照组的FEV1/FVC、FEV1/pred%降低，差异有统计学意义(P<0.001，表2)。表2 COPD组和对照组肺功能的比较(略)

　　2.3 AQP4表达与FEV1/FVC、FEV1/pred%的关系

　　AQP4表达和FEV1/FVC呈正相关，相关系数Rs=0.427(P<0.001)。AQP4表达和FEV1/pred%呈正相关，相关系数Rs=0.461(P<0.001)。

　　2.4 AQP4表达与支气管黏膜炎症程度的关系

　　AQP4表达与支气管黏膜炎症严重程度的关系呈负相关，AQP4表达与支气管黏膜炎症的相关系数Rs=-0.593(P<0.001，表3)。表3 AQP4表达与支气管黏膜炎症程度的关系(略)

　　3 讨 论

　　水通道蛋白(AQPs)是一组水选择性通道膜蛋白，其功能是增加细胞膜水的通透性，它提供了液体快速移动途径。AQP4存在于鼻、支气管纤毛细胞基底膜及肺泡上皮细胞膜[5]，主要功能是调节气道表面液体及气道湿化。当吸入气体干燥时气道表面液体水分蒸发以湿化气道，从而导致气道表面液体渗透压升高，气道表面液体渗透压升高可以激活丝裂原活化蛋白激酶传导通路(MAPK)，增加AQPs的表达。研究发现，敲除大鼠AQP4基因后，肺泡-毛细血管腔间渗透压驱动的水转运速率下降近90%，提示其在渗透压驱动的跨肺泡上皮和血管内皮屏障液体转运中起重要作用[6]。

　　AQPs的异常与疾病的关系已有诸多报道[7-9]。AQPs减少或功能障碍导致气道湿度减低，气道表面液体渗透压升高，高渗应激通过MAPK信号转导通路使炎症反应增加。而气道表面液体高渗，使上皮细胞分泌的许多内源性的抗生素杀菌效能减低。

　　气道湿度减低，黏液稠厚、积聚，会使黏液凝胶浓缩，抑制纤毛的黏液清除，使局部黏膜清除功能受损，并促进细菌的寄殖;气道湿度减低，导致显著的上皮损害和局部的炎症，纤毛广泛脱失，上皮脱落，上皮下血管渗漏、水肿，炎性细胞浸润，炎性介质(白三烯、血栓素、前列腺素)释放，支气管收缩，气道阻力增加，同时黏液生成减少，纤毛摆动功能进行性破坏，而病变部位产生的稠厚黏液进一步阻碍气流的湿化，使黏膜功能障碍进行性发展，炎症反应进一步加重。

　　炎症反应可引发气道内的炎性细胞释放大量的活性氧簇和多种蛋白水解酶，使体内氧化负荷加重，生物膜的正常结构和功能受损，并使体内的抗蛋白酶失活，同时激活MAPK信号转导通路，使炎症进一步得到加强，促使COPD的发生发展。

　　本实验结果表明：AQP4表达和FEV1/FVC、FEV1/pred%呈正相关，说明水通道表达减少，会使患者的气道湿化功能受到影响，导致气道湿度降低，影响患者的肺功能状况。COPD组较对照组AQP4表达减弱有极显著性差异(P<0.001)，AQP4表达和炎症程度负相关 ，说明AQP4表达越少，气道炎症程度越重。

　　AQP4的表达在COPD的发病过程中起了相当重要的作用。正常人和COPD患者气道存在AQP4表达差异，AQP4通过影响气道湿度使气道炎症恶化，使患者肺功进行性下降，气流受限进一步发展。因此，临床上可以尝试通过改善AQP4治疗COPD。

　　【参考文献】

　　[1]中华医学会呼吸病分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版) [J]. 中华结核和呼吸杂志，2007, 30(1):8-17.

　　[2]Pettersen CA, Adler KB. Airways inflammation and COPD: epithelial-neutrophil interactions [J]. Chest, 2002,121(5):142-150.

　　[3]李亚清，张珍祥，徐永健.基质金属蛋白酶的结构调控及与慢性阻塞性肺疾病的关系[J]. 国际呼吸杂志, 2006, 26(3):182-185.

　　[4]任少华. 氧化抗氧化治疗慢性阻塞性肺疾病的研究进展 [J]. 国外医学呼吸系统分册，2002, 22(2):91-93.

　　[5]Kreda SM, Gynn MC, Fenstermacher DA, et al. Expression and localization of epithelial aquaporins in the adult human lung [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2001, 24(3):224-234.

　　[6]Bai C, Fukuda N, Song Y, et al. Lung fluid transport in aquaporin-1 and aquaporin-4 knockout mice [J]. J Clin Invest, 1999, 103(4):555-561.

　　[7]许顶立，任昊，Martin PY，等.充血性心力衰竭大鼠肾脏aquaporin2水通道蛋白基因的表达 [J].中华医学杂志, 1998, 78(2):118-120.

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