流式细胞术测定Survivin基因在大肠癌中的表达及其意义

　　作者：王淑强 李 鹏 武 欣 郝秀轻 李秀娟 作者单位：(1.河北北方学院医学院病理教研室,河北 张家口 075000;2.山西医科大学麻醉系2005级2班，山西 太原 030000)

　　【摘要】 目的：研究Survivin基因在大肠癌中的表达及其与肿瘤发生、发展的关系。方法：流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测58例大肠癌(Colorectal carcinoma,CC)患者及10例正常者黏膜(Normal mucosa,NM)中Survivin表达情况，并结合临床病理相关因素，应用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。结果：FCM定量检测表明，正常黏膜组Survivin表达平均FI值为1.00±0.28，高、中、低分化腺癌及粘液腺癌组Survivin表达FI值分别为3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06。高、中、低分化腺癌及粘液腺癌组Survivin表达均明显高于正常黏膜组(P<0.05)。大肠癌淋巴结转移组平均FI值3.11±1.19，显著高于无淋巴结转移组2.26±1.38(P<0.05)。FCM结果显示Survivin表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位等无关(P>0.05)。结论：Survivin在大肠癌中表达异常增高，显著高于正常肠黏膜组织。Survivin在大肠癌中的表达与淋巴结转移密切相关。

　　【关键词】 大肠癌;Survivin基因;流式细胞术

　　Significance of Survivin Expression in Coloreatal Carcinomas Measured by FCM

　　WANG Shuqiang,LI Peng,WU Xin，et al

　　Department of Pathology,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate the expression of survivin in coloreatal carcinomas and relationship between its expression and tumorigenesis and development.Methods:The expression of Survin was studied in 58 cases with human colorectal carcinomas and 10 cases with normal colorectal carcinoma by FCM analysis.The clinical pathological significances of surbvivin expression in CC were statically analyzed by SPSS 11.0 software.Results:FCM results showed that Survivin expressions in well moderately and pooly differentiated CC colorectal carcinoma were.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48 and 3.31±1.06 respectively,which were all significantly higher than that of NM(1.00±0.28).The FI of surviving expression in CC cases with LNM and that without LNM were 3.11±1.19 and 2.26±1.38 respectively.The former was significantly higher than that of the later one(P<0.05).No remarkable correlations were found between surbvivin expression and other clinical pathological factors,such as age、sex or tumor location ect.(P>0.05). Conclusion: Expressions of survivin at protein level in colorectal carcinoma were significantly increased than that in normal colorectal mucosa. The expressions of the three mathers were increased in cases with LNM than that without LNM. The increased survivin expression in colorectal carcinoma was closely related to lymphnode metastasis.

　　【KEY WORDS】 Colorectal Carcinoma,Survivin,Flow Cytometry

　　大肠癌是常见消化道恶性肿瘤之一，患者的主要死亡原因是术后转移。近年来研究表明，Survivin在多种肿瘤中都是高表达，在肿瘤发生、发展、分化、转移中起重要作用。本实验采用流式细胞术检测58例大肠癌及10例大肠远端病理证实为正常黏膜(Normal mucosa,NM)中Survivin的表达情况，探讨其在大肠癌发生、发展和转移中作用，为大肠癌浸润和转移预测、预后判断提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集河北北方学院附属第一医院200503—200603月间手术切除的大肠癌标本58例，同时选取大肠远端病理证实为正常黏膜组织10例。58例大肠癌中男性28例，女性30例;年龄30～78岁;发生部位，结肠癌22例，大肠癌36例;组织分化程度：高分化腺癌26例，中分化腺癌20例，低分化腺癌6例，粘液腺癌6例;有淋巴结转移31例，无淋巴结转移组27例。所有标本蜡块均进行4～5μm连续切片，HE染色病理确诊。将剩余蜡块再进行切片做流式。

　　1.2 主要试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体，羊抗兔FITCIgG,DAB显色剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 单细胞悬液的制备

　　①把石蜡包埋组织切成40μm厚的组织切片，放入10mL的试管中。

　　②加入二甲苯8mL，在室温下脱蜡2d，期间更换二次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯。

　　③水化，依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5mL，每步10min，加入DW 5mL，10min弃之。

　　④消化，加入2mL 0.5%胰蛋白酶(pH=1.5)，置37℃恒温水浴中消化30min，在消化期间每隔10min，用振荡器震荡1次，消化30min，立即加生理盐水终止消化。

　　⑤经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可经第二次消化。

　　⑥收集细胞悬液，以1500r/min离心沉淀5min，生理盐水漂洗二次，以800r/min离心沉淀5min，去碎片。

　　1.3.2 细胞免疫荧光标记

　　取单细胞悬液1×106/mL,加入兔抗人Survivin多克隆抗体标记工作液0.1mL,室温孵育30min，加入PBS 10mL，洗涤一次，弃上清，加入羊抗兔FITCIgG二抗工作液100μL，避光室温孵育30min，加入PBS 10mL，离心同上，弃去上清，除去未结合的荧光抗体，上机检测前加入PBS 0.1mL，经500目铜网过滤后上机检测，在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。

　　1.3.3 流式细胞仪检测条件及参数，采用美国Beckman Coulter公司生产的EPICSXLII型流式细胞仪，应用Expo32ADC软件进行免疫荧光数据分析，测定前以标准微球调整仪器CV值在2%以内。

　　1.4 结果测定 以流式细胞仪分析软件给出的每例样品的平均荧光强度(Mode值)，计算荧光指数(fIuorescence Index,FI)，并以荧光指数显示Survivin基因蛋白表达强弱并进行相关的数据分析。

　　FI计算公式：FI=(样本基因蛋白表达荧光强度-正常样品的荧光强度)/正常样品的荧光强度。

　　1.5 统计学方法 数据库的建立和数据分析采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，Survivin基因表达的流式细胞仪检测结果进行单因素方差分析，P<0.05有统计学差异。

　　2 结果

　　Survivin基因在正常黏膜和不同分化组中的表达见表1。表1 Survivin基因在正常黏膜和不同分化组中的表达注：与正常黏膜组比较*P<0.01

　　Survivin基因在大肠癌的表达与临床病理特征的关系见表2。

　　Survivin基因表达的FI值在大肠癌有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。FCM检测结果Survivin基因表达与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位无相关(P>0.05)。表2 Survivin基因在大肠癌的表达与临床病理特征的关系注：与无转移组相比*P<0.05

　　3 讨论

　　Survivin是迄今发现最强的一种凋亡抑制因子，它定位于染色体17q25,是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中最小的成员，人的Survivin蛋白由142个氨基酸组成，为16.5KD，蛋白结构仅单个N端杆状病毒重复序列(baculovirus IAP repeat，BIR)有长的C端alpha螺旋区和二聚体排列结构，BIR结构被认为对凋亡起关键性作用。Survivin不仅在各种肿瘤中发生、发展中有重要作用，而且也是影响肿瘤预后的重要因素。

　　Survivin对肿瘤发生、发展机制包括①促进肿瘤血管形成;②促进肿瘤细胞增殖;③抑制细胞凋亡。Tran[1]研究发现，VEGF抑制化疗药物诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡是通过Survivin保护微血管网络稳定而实现。Survivin在血管内皮细胞、平滑肌细胞中的表达可能调节生理性修复或病理性(肿瘤)的血管形成，对肿瘤细胞的浸润迁移起着重要作用。在肿瘤细胞中，Survivin保持了维护细胞生存和调节细胞有丝分裂的功能。体内试验显示，使细胞强制表达Survivin能稳定微管，选择解聚，从而诱导有丝分裂，促进肿瘤细胞增殖[2]。而Survivin对肿瘤最重要的作用是抑制肿瘤细胞凋亡。外界某些凋亡刺激因子激活caspase[3,4],通过线粒体释放细胞色素C，激活胞质内的caspase级联反应，形成了由procaspase9、Apaf1、细胞色素C和dATP组成的凋亡小体，最终激活caspase3和caspase9而导致细胞凋亡。

　　Survivin基因在人正常组织中表达是静息的，在生理状态下除成人子宫内膜和咽腺组织中有不同程度的表达外，大多数细胞中检测不到，但在许多恶性肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤组织中存在着不同程度的表达。Sarela[5]等对86例结肠癌组织进行了Survivin mRNA测定，发现Survivin mRNA 存在于近半数Survivin阳性的癌组织周围，而Survivin阴性的癌组织周围无1例Survivin mRNA存在。在评估Survivin蛋白表达和大肠癌各临床病理学参数的关系时，本实验用流式细胞术对Survivin在大肠癌中的表达进行了检测。FCM结果显示，正常黏膜组Survivin表达FI值为1.00±0.25，高、中、低分化腺癌Survivin表达FI值分别为3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48，与正常黏膜组比较有统计学差异，提示Survivin可能在大肠癌发生、发展过程中发挥着重要作用。FCM结果显示，淋巴结转移组的Survivin表达平均FI值为3.11±1.19，显著高于无淋巴结转移组2.26±1.38，两组间存在显著差异，提示Survivin的表达预示着大肠癌患者淋巴结转移率较高。多方面研究提示Survivin是一种癌基因，是具有潜在价值的肿瘤标志，Survivin基因可作为一个较为普遍的标志物用于结肠癌的早期诊断[6]。Survivin在各种恶性肿瘤组织中都有选择性表达的特性，可能是参与各种恶性肿瘤发生的关键因素。进一步研究Survivin与大肠肿瘤关系可更好的提示大肠肿瘤发生的分子机制。

　　【参考文献】

　　1 Tran I,Master I,Yu JL,et al. A role for Survivin in chemotsistance of endothelial cells mediated by VEGF[J]. Prcc Natl Acad Sci USA, 2002,99(7):43494354

　　2 Giodini A,Kallio MJ,Wall NR,et al .Tegulation of microtubule stability and mitoticprogression by Survivin[J].Cancer Res,2002,69(9)24622467

　　3 Mckay TR,Bell S,Tenev T,et al . Procaspase3 expression in ovarian carcinoma cells increases Survivin transcription which can be countered with a dominantnegative mutant,Survivin T34A,a combination gene therapy strategy[J].Oncogene,2003,22:35393547

　　4 Chiou SK,Jones MK,Tarnawski As.Survivinanantiapoptosis protein:its biological roles,and implications for cancer and beyond[J]. Med Sci Monit, 2003,9:125129

　　5 Sarela AI,Macadam RC,Farmery SM,et al.Immunohistochemical detection of the antiapoptosis protein,survivin,predicts survival after curative resection of stageⅡ colorectal carcino mas[J].Ann Surq Oncol,2001,8(4):305310

　　6 Zhang JY,Casi ano CA,peng XX,et al .Enhancement of antibody detection in cancer using panel of reoombinant tumorassociated angens[J].Cancer Epidem Biomar,2003,12(2):136143