拉莫三嗪对围生期缺氧导致惊厥的新生大鼠的神经保护作用

　　作者：王明欢1，邓燕2，蒋犁1，何农跃2 作者单位：(1. 东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009; 2. 东南大学 生物电子国家重点实验室，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的:探讨拉莫三嗪(LTG)对围生期缺氧导致惊厥的新生大鼠(生后10 d)的神经保护作用。方法：新生大鼠随机分成缺氧生理盐水组、缺氧LTG组、常氧生理盐水组和常氧LTG组4组。缺氧生理盐水组(n=26)：用梯度缺氧方法制作急性缺氧模型(氧浓度低于4%)，缺氧前0.5 h已腹腔注射生理盐水;缺氧LTG组(n=26)：腹腔注射LTG(20 mg·kg-1)，0.5 h后放入同上的缺氧装置;常氧生理盐水组(n=26)：腹腔注射生理盐水后放入常氧浓度的相同装置;常氧LTG组(n=26)：腹腔注射LTG后放入同上的常氧浓度装置。尼氏染色评估惊厥发作1 h后及生后30 d大鼠的细胞丢失情况，Timm染色观察生后30 d大鼠的苔藓纤维发芽情况，戊四氮测量生后30 d大鼠的惊厥敏感性。结果：尼氏染色结果显示各组大鼠在惊厥发作1 h及生后30 d的两个时间点均未见明显神经元丢失。缺氧LTG组在围生期缺氧惊厥的程度及敏感性与缺氧生理盐水组无明显差异，常氧两组均未见惊厥发作。但在生后30 d，缺氧LTG组大鼠对戊四氮的惊厥阈值较缺氧生理盐水组明显增高(P<0.05)，较常氧组降低(P<0.01)，常氧两组间无差异(P>0.05)。缺氧LTG组大鼠在生后30 d时，齿状回颗粒上层的苔藓纤维发芽分数较缺氧生理盐水组明显降低(P<0.05)，但与常氧两组间均无明显差异。结论：拉莫三嗪对围生期缺氧导致惊厥的大鼠有神经保护作用，降低了大鼠对化学致痫药物的敏感性，并且阻止了远期发展为癫痫的可能。

　　【关键词】 拉莫三嗪; 新生大鼠; 缺氧; 惊厥; 神经保护作用; 苔藓纤维发芽

　　Neuroprotective effects of lamotrigine on neonatal rats after

　　perinatal hypoxiainduced seizures

　　WANG Minghuan1, DENG Yan2, JIANG Li1, HE NongYue2(1. School of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. State Key Laboratory

　　of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the possible neuroprotective effects of lamotrigine(LTG) on neonatal rats after hypoxiainduced seizures at postnatal day 10. Methods: Four groups of rats were studied at postnatal day 10. Rats in hypoxianormal saline(NS) group(n=26) were subjected to acute hypoxia at postnatal day 10 according to the protocol of progressively decreasing oxygen(down to 4% O2) and intraperitoneally injected with NS half hour before hypoxia. Rats in hypoxiaLTG group(n=26) were subjected to acute hypoxia and received LTG(20 mg·kg-1) intraperitoneally half hour before hypoxia. Rats in normoxiaNS group(n=26) were injected with NS and placed in normal oxygen apparatus. NormoxiaLTG group(n=26) were injected with LTG and placed in normal oxygen apparatus. Nissl staining was performed to evaluate cell loss at one hour after onset of seizure and at postnatal day 30. Timm staining was performed to evaluate mossy fiber sprouting and seizure susceptibility was tested by pentylenetetrazol( PTZ) at postnatal day 30. Results: Nissl staining showed that there was no obvious neuronal loss after seizure induction at either postnatal day 10 or postnatal day 30 in all groups. The degree of seizure and seizure susceptibility of rats in hypoxiaLTG group was similar to that in hypoxiaNS group. The seizure threshold induced by PTZ of the rats in hypoxiaLTG group was significantly higher than that in hypoxiaNS group(P<0.05) and lower than that in the two normoxia groups at postnatal day 30(P<0.01).There was no obvious difference between the two normoxia groups(P>0.05). Timm staining showed that supragranular zone of the dentate gyrus in hypoxiaLTG group was lower than that in hypoxiaNS group(P<0.05), but there was no obvious difference in the two normoxia groups at postnatal day 30. Conclusions: These results suggest that the potential neuroprotective effect of lamotrigine in these particular animal model of perinatal hypoxiainduced seizures. LTG decreased the longterm seizure susceptibility induced by chemical convulsant and prevented the later development of epilepsy.

　　[Key words] lamotrigine; neonatal rats; hypoxia; seizure; neuroprotective effects; mossy fiber sprouting

　　围产期缺氧是新生儿惊厥和新生儿脑病最常见的原因，对儿童的神经发育有潜在的长期影响，包括轻微的行为异常、严重的抽搐、智力发育迟滞和脑性麻痹等[1]。新生儿缺氧也是导致慢性癫痫的一个危险因素。而且，新生儿缺氧合并惊厥会使惊厥持续时间延长，甚至可能导致常规的抗惊厥治疗药物无效[2]。目前常用的抗痫药物，如巴比妥类、苯妥英那、苯二氮卓类，对发育脑都有副作用，所以我们需要寻找一种有效的、耐受性好、副作用少的新型抗痫药物来替代[3]。拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)是一种新型抗癫痫药，有效应用于成人全身强直阵挛性抽搐，也用来辅助治疗癫痫或是作为单一的抗痫治疗药物。但国内外对LTG在新生期的应用鲜有研究，LTG对围生期缺氧惊厥大鼠的作用尚未报道。本实验制作了新生期缺氧性脑病模型，观察LTG是否可以降低缺氧惊厥新生大鼠的惊厥敏感性及从一定程度上阻止向癫痫发展的可能，是否具有神经保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型制作和分组

　　10日龄同窝SD大鼠104只，雌雄不限，体质量14～18 g，由复旦大学提供鼠种，东南大学医学院实验动物中心繁殖。大鼠随机分成缺氧生理盐水组、缺氧LTG组、常氧生理盐水组和常氧LTG组4组。缺氧生理盐水组(n=26)：新生大鼠在缺氧前0.5 h预先腹腔注射生理盐水0.1 ml，然后根据逐步梯度降低氧浓度的方法造成急性缺氧的模型(在密闭装置中依次通入7%氧浓度8 min,7%～6%的氧浓度2 min 30 s,6%氧浓度4 min,6%～5%氧浓度3 min 40 s,5%氧浓度2 min,5%～4%氧浓度5 min,4%氧浓度1 min[4]);缺氧LTG组(n=26)：同上方法制作急性缺氧模型，缺氧前0.5 h已腹腔注射LTG(20 mg·kg-1);常氧生理盐水组(n=26)：腹腔注射等量生理盐水后放入常氧浓度的相同装置;常氧LTG组(n=26)：腹腔注射等量LTG后放入同上的常氧浓度装置。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药物惊厥易感性测定

　　生后30 d，分别给予各组8只大鼠每隔5 min腹腔注射致痫药戊四氮(PTZ)(Sigma公司)10 mg·kg-1,直至出现第1次后冲性肌阵挛的发作,即肌阵挛导致头和肩向后抽动[5]。记录出现第1次后冲性肌阵挛或全身性阵挛发作所需的时间(即潜伏期)及注射的药物总剂量。

　　1.2.2 组织切片制备及染色

　　1.2.2.1 切片制备 (1) 石蜡切片：造模后1 h及生后30 d,分别予各组6只大鼠2%戊巴比妥过量麻醉,左心室插管灌注4%多聚甲醛固定取脑，然后继续用4%多聚甲醛后固定12 h后取海马部位的脑组织常规石蜡包埋，在视交叉后1 mm处做冠状切片，用作尼氏染色。(2) 冰冻切片：生后30 d,分别予各组6只大鼠2%戊巴比妥过量麻醉,先后灌注0.4%硫化钠,2%多聚甲醛和1.5%戊二醛混合液固定取脑，再用4%多聚甲醛后固定24 h，最后置于30%的蔗糖溶液中过夜,待鼠脑沉底后，在海马部位做冠状冰冻连续切片,切片厚30 μm，用作Timm染色。

　　1.2.2.2 尼氏染色 取石蜡切片，脱蜡后入二甲苯溶液3 min,然后依次浸入100%、95%、70%的酒精各3 min，蒸馏水浸洗3 min，然后入1%的甲苯胺蓝染色6～10 min，最后蒸馏水冲洗,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.2.2.3 Timm染色 将冰冻切片自然晾干,三蒸水冲洗，然后放入预先配制的混合液中(该混合液含有50%阿拉伯树胶120 ml、5.78%氢醌60 ml、51%柠檬酸10 ml、47%柠檬酸钠10 ml),染色前将17%硝酸银溶液1.4 ml放入上述混合液中，置于黑暗处孵育40～60 min,流水冲洗15 min终止染色。切片自然晾干后,梯度酒精脱水、透明、封片。半定量评分,评分标准按照苔藓纤维出芽分级表进行,观察CA3区和齿状回颗粒细胞上层苔藓纤维发芽的情况。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以±s表示,应用SPSS 13.0软件进行成组设计的单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 行为学观察

　　生后10 d新生大鼠被放入7%氧浓度的密闭装置约2 min后均出现了机械性咀嚼、点头，然后进展为呼吸困难、嘶叫及狂奔，全部达到了Lado评分的3.5级以上的惊厥发作，放回常氧环境中约2 min左右完全停止惊厥发作。缺氧生理盐水组与缺氧LTG组惊厥发作的程度及潜伏期没有明显差异(P>0.05)。放入缺氧装置的所有大鼠均未死亡，常氧装置中的新生大鼠均未有惊厥发作，亦无死亡。

　　2.2 药物惊厥阈值

　　生后30 d的各组大鼠经PTZ诱发后均出现惊厥发作。PTZ诱发惊厥的用量为50～80 mg·kg-1，缺氧LTG组为(58.57±3.77) mg·kg-1，缺氧生理盐水组为(52.50±4.62) mg·kg-1,常氧LTG组为(68.75±6.40) mg·kg-1，常氧生理盐水组为(66.25±5.17) mg·kg-1，缺氧生理盐水组大鼠引出惊厥发作的药物剂量最小，除了常氧两组间无差异，其余各组间均有明显差异(P<0.05)。出现肌阵挛抽动的平均潜伏期在缺氧LTG组为(27.14±1.57)分，缺氧生理盐水组为(24.12±2.16)分,常氧LTG组为(32.12±2.99)分，常氧生理盐水组为(31.62±2.82)分，缺氧生理盐水组大鼠出现后冲性肌阵挛的平均潜伏期显著短于其他各组(P<0.05)，除常氧两组间无差异外，其余各组均有差异(P<0.05)。缺氧LTG组惊厥发作时死亡1只，其PTZ剂量为70 mg·kg-1。

　　2.3 尼氏染色结果

　　各组大鼠在早期(造模后1 h)及晚期(生后30 d)两个时间点，CA1区、CA3区、齿状回颗粒细胞层、门区均可见大量排列紧密的锥体细胞和颗粒细胞，门区可见呈现蓝色的神经元,各区均未见明显的神经元丢失。

　　2.4 Timm染色结果

　　缺氧生理盐水组大鼠的Timm染色与其它3组有差异。缺氧生理盐水组大鼠的齿状回颗粒细胞上层可见少许黄褐色的Timm颗粒(图1箭头所示)，而其他3组的颗粒细胞上层均未见明显的Timm颗粒(图2～4)。各组的CA3区均未见明显苔藓纤维发芽。缺氧生理盐水组的Timm记分为1.16±0.40，缺氧LTG组为0.33±0.51，常氧生理盐水组为0.16±0.40，常氧LTG组为0.16±0.40，缺氧生理盐水组Timm记分明显高于其他3组(P<0.05),另外3组间Timm记分无明显差异(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　国外研究已经发现新生儿脑的不同区域对缺血/缺氧脑损伤敏感性是不同的。早产儿的脑损伤多造成脑白质的损害，而足月儿则多为灰质的损害，所以，早产儿多患脑室周围白质软化，而足月儿多患新生儿惊厥[6]。出生后10 d的新生大鼠相当于人类的足月儿。国外一个经典的缺氧性脑病的鼠模型表明，只有在出生后10～12 d的新生鼠才能导致自发性惊厥和慢性脑损伤[7]。在这个年龄组，缺氧惊厥增强了海马神经网状系统的长期兴奋性，增加了日后惊厥致神经损害的敏感性，也导致了成年后海马神经元细胞的丢失和记忆力的缺陷[8-9]。

　　LTG是一种新型的抗痫药,其作用机制是通过抑制突触前神经元电压门控的Na+通道和Ca2+通道，从而抑制谷氨酸的过度释放。早些年，LTG已在成年动物脑缺血模型中证实有脑神经保护作用。近年在新生鼠缺氧缺血性脑病模型中亦证明LTG可以减少脑神经细胞的死亡，以及通过减少兴奋性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸的释放而降低兴奋性毒性，从而对脑损伤起神经保护作用。而且，LTG的神经保护作用具有剂量依赖性[10]。大量的成人临床试验及动物实验中尚未发现LTG有传统抗痫药损害认知等方面的副作用，所以，LTG可能是潜在的围生期惊厥致脑损伤的神经保护药物。

　　本实验发现，单剂量20 mg·kg-1 LTG的应用虽然不能迅速减轻缺氧引起的惊厥程度和延长惊厥发作的潜伏期，但提高了大鼠幼年期(生后30 d)对药物致痫剂的耐受性。所以，LTG对围生期缺氧惊厥大鼠有远期的保护作用。缺氧LTG组测药物惊厥阈时死亡1只(PTZ剂量为70 mg·kg-1)，考虑与其对致痫药物耐受性增加，最终导致实验药物总剂量过大有关。既往研究[5]发现，围产期缺氧惊厥大鼠在生后45～60 d时惊厥阈有明显差异，而本实验发现各组大鼠在生后30 d，即相当于人类的幼年期已显示出差异，说明围产期缺氧惊厥及LTG在发育早期即可出现相应的影响。以上结果提示LTG应在生后早期干预，而并非在再次出现惊厥时才用药，从而更好地预防惊厥的再次发作及提高幼年期的学习能力。

　　国外实验[9]表明，单纯围产期缺氧惊厥大鼠只有在成年(生后60 d)后才发现有神经元的丢失，同样，我们在实验后当天及生后30 d均未发现有明显神经元的丢失。由此，我们推测幼年期至成年期之间有个神经细胞发育的关键时期，决定着成年后神经细胞的丢失情况。其次，神经元丢失的情况可能也与缺氧的程度有关。

　　苔藓样纤维发芽为癫痫的一个典型病理特征。Timm染色法用来染色含锌的颗粒细胞轴突。国外实验中用甲紫酚和Timm复染法发现，新生鼠单侧颈总动脉结扎的缺氧缺血性脑病模型中，双侧鼠脑均有苔藓纤维发芽[11]。而本实验发现缺氧生理盐水组可见苔藓纤维发芽，而缺氧LTG组和常氧组均未见明显发芽，说明围产期缺氧惊厥增加了将来癫痫发生的可能，而LTG从一定程度上抑制了苔藓纤维发芽，所以可能对阻止将来发展为慢性癫痫起了保护作用。至于为何本次实验中苔藓纤维发芽结果不如缺氧缺血性脑病模型明显，考虑与单纯缺氧不如缺氧缺血造成的脑损害严重有关，这已在国内相关实验中证实[12]。

　　本次实验只研究了单剂量LTG应用于围产期缺氧惊厥大鼠的作用，那么LTG应用多大剂量、多少疗程可以发挥最有效保护作用且副作用最小呢?而且由于我们用药是在特殊的时期——新生儿期，所以药物的安全性及副作用也待进一步的深入研究。其次，如果能进一步选择未成年期(生后30～60 d)大鼠的多个时间点观察其组织学及行为学变化，则能更精确地了解LTG对脑神经细胞作用的时间点，这对确定用药的时间点、用药疗程及避免长期应用LTG可能引起的副作用都具有一定的指导意义。

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