结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响

　　作者：2，吴国球3，苟丽霞1 作者单位：(1. 东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009; 2. 东南大学附属中大医院 呼吸科，江苏 南京 210009;3. 东南大学附属中大医院 临床检验中心，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的治疗作用。方法：昆明小鼠36只，随机分为对照组、模型组和治疗组，每组12只;对照组气管内滴入生理盐水，模型组和治疗组气管内滴入博莱霉素(5 mg·kg-1)制备肺纤维化模型。第2天开始治疗组尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1)，对照组和模型组给予等量的生理盐水(约100 μl·次-1)，3次·周-1。第14、28天分两批处理动物，用HE染色行病理组织学检查并进行纤维化分级，用酸水解法测定肺组织羟脯氨酸的含量。结果：对照组小鼠肺组织无纤维化形成;模型组肺组织可见肺泡破坏，肺泡间隔大量纤维化，肺组织中羟脯氨酸含量及纤维化程度较对照组明显增高(P<0.01)。治疗组肺组织纤维化程度较模型组明显减轻，且羟脯氨酸含量较模型组显著降低(P<0.01)。结论：ScFv作为CTGF单链抗体可明显减轻纤维化程度，有可能成为治疗肺纤维化一种新的药物。

　　【关键词】 结缔组织生长因子单链抗体; 羟脯氨酸; 肺纤维化; 小鼠

　　The effect of ScFv against CTGF on bleomycininduced pulmonary

　　fibrosis of mice and hydroxyproline content

　　LIU Zhaozhao1, WANG Xihua2, WU Guoqiu3, GOU Lixia1(1. School of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Respiratiory, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China; 3. Center of Clinical Laboratory Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate therapeutic effect of singlechain variable fragment(ScFv) against connective tissue grouth factor(CTGF) on bleomycininduced pulmonary fibrosis of Kunming mice. Methods： 36 Kunming mice were randomly divided into three groups: the control group, the model group and the treatment group, 12 rats in each group. Mice in the control group were injected with normal saline via trachea, mice in the model and treatment group were injected with bleomycin(5 mg·kg-1) via trachea for preparing models. Then, mice the treatment group were injected with ScFv(4 mg·kg-1) via intravenous, and the mice in the other groups were injected with normal saline(about 100 μl·time-1)via intravenous, 3 times·week-1. After be modeled 14 and 28 days, dealing with animals by hematoxylineosin staining for histopathological examination and fibrosis grade, by acid hydrolysis for assaying lung hydroxyproline content. Results： There was no pulmonary fibrosis in the control group; in the model group, a large number of alveolus damaged, alveolar septum fibrosis, hydroxyproline content and fibrosis were significantly higher than that in the control group(P<0.01); in the treatment group, lung fibrosis was significantly alleviated and the content of hydroxyproline was significantly lower than that in the model group(P<0.01). Conclusion： ScFv against CTGF can delay the fibrosis, which may become a new cure for pulmonary fibrosis.

　　[Key words] singlechain variable fragment against connectwe tissue growth factor; hydroxyproline; pulmonary fibrosis; mice

　　肺纤维化是严重威胁人类健康的致死性肺部疾病，病人平均生存时间为3～5年。目前特发性肺纤维化病人呈逐年增多的趋势[1-3],其病变以肺间质中间质细胞的异常增殖、弥漫性或局限性成纤维细胞灶(主要由成纤维细胞和肌成纤维细胞组成)的存在为主要病理特征。研究证实成纤维细胞灶的数量与肺功能的减退、病情的进展和预后密切相关[4]。目前尚无有效的内科治疗手段可以逆转或者缓解自然病程的进展。鉴于结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在成纤维细胞活化过程中发挥重要作用，因此，本实验目的在于通过拮抗CTGF在肺纤维化中的作用寻找肺纤维化新的治疗方法。本实验利用博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，通过监测各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量及肺纤维化程度评分，观察CTGF单链抗体(ScFv)对小鼠肺纤维化的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及试剂

　　昆明小鼠36只，雌性，平均体质量(18±1) g，购于南通大学医学院实验动物中心;博莱霉素(15 mg·支-1)，为日本化药株式会社产品;ScFv由本实验室通过基因工程技术获得;羟脯氨酸试剂盒由南京建成生物技术研究所生产。

　　1.2 肺纤维化模型制作及标本采集

　　参照文献[5]报道制作小鼠肺纤维化模型。实验小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组12只。对照组小鼠予50 μl生理盐水气管内滴入,模型组和治疗组小鼠予博莱霉素(5 mg·kg-1)缓慢气管内滴入。第2天开始，治疗组小鼠尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1)，模型组及对照组小鼠尾静脉注射等量生理盐水(约100 μl·次-1)，3次·周-1。3组小鼠分别于第14、28 天，通过腹主动脉放血各处死6只。开胸取肺，将右下肺以100 g·L-1中性福尔马林固定,包埋、切片;左肺和右中上肺分别置液氮中保存备用。

　　1.3 肺组织形态学分析

　　将小鼠右下肺固定于100 g·L-1中性福尔马林24 h，经脱水、浸蜡、包埋后制作成石蜡切片(厚度约4 μm)，HE染色后观察肺组织病理学改变，了解肺组织纤维化程度。由病理科医生在显微镜下观察肺组织病理学变化(双盲法)，根据Szapiel等[6]方法，将肺纤维化程度分级如下：(1) 无纤维化(-);(2) 轻度肺纤维化(+),病变范围<20%,累及胸膜及胸膜下肺实质，肺泡结构发生改变;(3) 中度肺纤维化(++)，病变范围20%～50%，肺纤维化从胸膜开始蔓延，但仍属局部;(4) 重度肺纤维化(+++)，弥散性肺纤维化，病变范围>50%，融合损伤伴广泛肺实质结构紊乱。肺纤维化程度计分：(-)为0分，(+)为1分，(++)为2分，(+++)为3分。

　　1.4 羟脯氨酸含量测定

　　每个肺组织样本均称取30 mg，严格按照试剂盒说明书进行操作，最终测得各个样本羟脯氨酸的吸光度，按下列公式计算羟脯氨酸含量：羟脯氨酸含量(μg·ml-1)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管羟脯氨酸含量(5 μg·ml-1)×(水解液总体积/取样量)。

　　1.5 统计学处理

　　实验所得数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计分析软件进行方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织形态学分析

　　2.1.1 大体观察 对照组小鼠两肺呈粉红色，表面光滑，富有弹性。模型组小鼠第14天时两肺呈暗红色，表面凸凹不平，弹性差;第28天时两肺色泽较苍白，体积缩小，弹性差，质硬，表面结节样改变，还可见陈旧出血点。治疗组小鼠第14天时肺与对照组无明显区别，第28天时两肺表面可见少量瘢痕样改变，有弹性，体积与对照组无明显区别。

　　2.1.2 光镜观察 各组肺组织标本经HE染色后光镜下可见：对照组各个时间段肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺泡间隔规整，肺泡内未见渗出样改变(图1A)。模型组第14天时两肺肺泡及肺泡间隔内大量炎症细胞浸润，肺泡间隔可见成纤维细胞，肺泡间隔增宽(图1B);第28天肺泡萎陷，肺泡间隔内可见大量成纤维细胞(图1C)。治疗组第14天炎症较模型组明显减轻，纤维化程度也明显减轻(图1D);第28天可见少量肺泡壁破坏，肺泡壁略有增厚，肺泡间隔可见成纤维细胞，但纤维化程度明显较模型组轻(图1E)。图1 各组小鼠肺组织HE染色结果(×400)

　　Fig 1 Hematoxylineosin staining of lung in each group(×400)2.1.3 病理学变化(肺纤维化评分) 对照组小鼠肺组织结构正常，未见纤维化改变;模型组小鼠两个时间段均出现纤维化改变，且第28天较第14天病变范围及程度大;治疗组小鼠肺组织虽然也出现纤维化改变，但较模型组明显减轻。对照组、模型组、治疗组肺纤维化程度评分有统计学差异(P<0.01)。模型组肺纤维化程度评分明显高于对照组(P<0.01)和治疗组(P<0.05)。见表1。表1 第14、28天各组肺纤维化程度评分比较

　　2.2 羟脯氨酸含量测定

　　3组小鼠肺组织羟脯氨酸含量在第14天和第28天均有统计学差异(P<0.01)。模型组第28天羟脯氨酸含量明显高于第14天(P<0.05)，治疗组第28天羟脯氨酸含量明显低于第14天(P<0.05)。见表2。表2 第14、28天各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量比较(±s)

　　3 讨 论

　　肺纤维化是由多种原因引起的慢性肺疾病的共同结局，其病理特点是肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质(ECM)的反复破坏、修复、重建和过度沉积。国内外治疗特发性肺纤维化目前尚无最佳方案，常规治疗包括皮质激素、免疫抑制剂、抗纤维化制剂等。这些药物可以起到一定的抑制炎症、延缓纤维化发展的作用，但它们的疗效并不显著，特异性不强，且存在严重的毒、副作用。研究发现，成纤维细胞灶的数量与肺功能的减退、病情的进展和预后密切相关。在众多细胞因子中转化生长因子β(TGFβ)和CTGF是公认的致肺纤维化形成与发展的最重要的细胞因子。TGFβ是“开关性”细胞因子，生物学活性非常广泛。然而，TGFβ并不能直接诱导成纤维细胞的增殖和表型的转化，其单独作用不能引起纤维化，但它能增强CTGF诱导肌成纤维细胞生成的效应，其促纤维化的信号通过CTGF向下转导[7-8]。靶向性阻断其表达虽可起到抗纤维化的作用，但也同时阻断了其他生物学功能的发挥，产生严重的副作用。而CTGF作为TGFβ的下游效应介质，作用比较单一，主要介导TGFβ的促纤维化作用，并且它只在间质细胞中表达，其作用也只局限于结缔组织。因此，阻断CTGF的生物学活性可能会成为抗肺纤维化的亮点。目前已经证实CTGF与成纤维细胞的活化、增殖及ECM合成密切相关，在肺纤维化形成过程中直接或间接地发挥作用[9]，而羟脯氨酸含量反映了肺组织中胶原的含量，可以用来评估肺纤维化程度。CTGF的相关研究已经成为目前防治脏器纤维化的研究热点。

　　CTGF ScFv是本实验室通过基因工程技术在原核细胞中表达得到的。该抗体是采用“噬菌体展示技术”从噬菌体人源抗体库(Griffin.1 Library)中筛选获得的一个与CTGF特异结合的全人源化的小分子单抗序列，为单链可变区片段，相对分子质量25 000。体外实验初步显示，ScFv能与CTGF发生特异性结合，并能有效抑制CTGF的生物学活性[10]。

　　目前国内外尚无针对拮抗CTGF研究肺纤维化的报道，本研究发现ScFv可在肺纤维化小鼠肺组织内阻断CTGF的生物学活性，从而减轻肺纤维化。由于是全人源的单链抗体，只含有V区，因此免疫原性更小，有利于减弱或消除排异反应;另外其分子质量小(为完整Ig分子的1/6)，易穿透组织到达病变部位;且无Fc区，可减少非特异性结合，因此在应用时具有独特优势。因此ScFv可能会成为治疗肺纤维化的新药物。

　　【参考文献】

　　[1] 程继荣,齐曼古力·吾守尔,何元兵,等.特发性肺纤维化患者血清结缔组织生长因子和纤维连接蛋白水平研究[J].临床肺科杂志,2007,12(2):128129.

　　[2] 张晓晓,刘文瑾.抗肿瘤药致肺纤维化临床分析[J].临床误诊误治,2007,20(8):7980.

　　[3] 徐淑凤,陈良安,方向群.特发性肺纤维化患者肺功能测定与CT征象相关性的探讨[J].中国医师进修杂志,2007,30(9):2224.

　　[4] KING T E Jr, SCHWARZ M I, BROWN K, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: relationship between histopathologic features and mortality[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001,164(10):10251032.

　　[5] ENDO M, OYADOMARI S, TERASAKI Y, et al. Induction of arginase Ⅰ and Ⅱ in bleomycininduced fibrosis of mouse lung[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Phydiol,2003,285(2):L313321.

　　[6] SZAPIEL S V， ELSON N A， FULMER J D， et al. Bleomycininduced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J]. Am Rev Respir Dis, 1979,120(4):893899.

　　[7] QI W, CHEN X, PORONNIK P, et al. Transforming growth factorbeta/connective tissue growth factor axis in the kidney[J]. Int J Biochen Cell Biol,2008,40(1):913.

　　[8] LEASK A, PARAPURAM S K, ABRAHAM D J, et al. Connective tissue growth factor(CTGF, CCN2) gene regulation: a potent clinical biomarker of fibroproliferative disease?[J]. J Cell Commun Signal，2009,3(2):8994.

　　[9] CHAUDHARY N I, ROTH G J, HILBERG F, et al. Inhibition of PDGF, VEGF and FGF signalling attenuates fibrosis[J]. Eur Respir J, 2007,29(5):976985.

　　[10] 吴国球,刘乃丰,赵桂琴,等.人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选[J].中国药科大学学报,2007,38(5):464468.