非小细胞性肺癌病人相关细胞因子的表达

　　作者：刘瑞贞 作者单位：青岛市中心医院呼吸内科，山东 青岛 266042

　　【摘要】 目的 探讨非小细胞性肺癌(NSCLC)病人局部微环境中免疫反应特点及其对抗肿瘤免疫的影响。方法 以5例结核性胸膜炎病人作为对照,采用地高辛末端标记的寡核苷酸探针,以原位杂交技术检测了23例NSCLC病人的新鲜胸腔积液和(或)手术切除标本淋巴细胞和肿瘤细胞中IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10、TGF-β1、IL-1、IL-3、IL-8、GM-CSF、TNF-α及TGF-α mRNA的表达。结果 病人胸腔积液的单个核细胞及肿瘤组织中, IL-4、IL-10、TGF-α和TGF-β1 mRNA的表达水平明显高于IL-2、IL-12、IL-18、INF-γ;而结核性胸腔积液的单个核细胞中上述细胞因子的水平均降低,并且各细胞因子的表达水平之间没有明显的差异。结论 NSCLC病人胸腔积液的单个核细胞及肿瘤组织中,Ⅱ型细胞因子和免疫抑制细胞因子mRNA的表达占主导地位,反映了肿瘤局部的免疫微环境处于抑制状态。上述结果有助于了解肿瘤逃逸的机制,并为制定NSCLC免疫治疗的方案提供了重要的实验依据。

　　【关键词】 癌 非小细胞肺 细胞因子类 原位杂交

　　THE EXPRESSION OF CYTOKINE mRNA IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER LIU RUI-ZHEN, XU LUO, WEI XIAO-FANG(Department of Respirology, Qingdao Central Hospital, Qingdao 266042, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo explore the characteristics of immune responses in the microenvironment of non-small cell lung cancer (NSCLC). MethodsIn situ hybridization (ISH) with digoxin end-labeled oligonucleotide probe was used to detect mRNA expressions of cytokines in fresh pleural effusion samples and tumor tissue samples of 23 NSCLC patients. Five tuberculous pleurisy patients served as controls. ResultsThe mRNA expression of IL-4, IL-10, TGF-α and TGF-β1 in tumor tissue and mononuclear cells from pleural effusion of NSCLC patients were significantly higher than those of IL-2, IL-12, IL-18 and INF-γ. In contrast, the mRNA expression of IL-4, IL-10, TGF-α and TGF-β1 in tuberculous pleural effusion samples was decreased. There was no significant difference in mRNA expression among different samples of tuberculous pleurisy patients.ConclusionThe mRNA expressions of type Ⅱ cytokines and immunosuppressive cytokines predominated in the pleural effusion and tumor tissue of NSCLC patients, suggesting an immunosuppressive microenvironment around the tumor. The results contribute to a better understanding of the mechanisms of tumor escape and provide an important experimental basis for working out the scheme for an effective immunomodulatory treatment of NSCLC patients.

　　[KEY WORDS]Carcinoma, non-small cell lung; Cytokines; In situ hybridization

　　非小细胞性肺癌(NSCLC)是常见的恶性肿瘤,发病率逐年上升。其治疗手段有限、预后差,尤其是免疫治疗的疗效甚微,其疗效的提高有赖于对肿瘤局部免疫微环境的深入了解。本研究采用原位杂交技术检测了NSCLC肿瘤局部较为重要的13种细胞因子的表达,并探讨了各种细胞因子的表达与肿瘤病理分期的关系。另外,在单细胞水平上,检测了癌性胸腔积液的淋巴细胞中上述13种细胞因子的表达,并以结核性胸膜炎病人胸腔积液中的淋巴细胞作为对照,探讨了肿瘤局部的免疫微环境对抗肿瘤免疫应答的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　5例结核性胸膜炎病人的胸腔积液标本及23例NSCLC病人(腺癌15例,鳞癌8例)的肿瘤组织标本,均来自青岛大学医学院附属医院。寡核苷酸地高辛标记试剂盒购自德国宝灵曼公司。细胞因子的寡核苷酸探针由上海博亚生物技术公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 寡核苷酸探针的制备 应用Primer 3软件设计针对细胞因子的寡核苷酸探针。探针的特异性均经BLAST软件测试,显示具有良好的特性。检测各种细胞因子mRNA的探针序列如下。IL-1：5′-ATGATAGAAGGATTTCTGATTCAGAGA-3′;IL-2:5′-GTTCTTCTTCTAGACACTGAAGCTGT-T-3′;IL-3：5′-TGCTTTAAGTGTGTTATAATTT-CATCG-3′;IL-4：5′-ATATTCAAAGTGTTCGAG-CTGAATATT-3′;IL-8：5′-TTGTTTGTTTGTT-TAATCTAAAAACCC-3′;IL-10：5′-AGGCTTCT-ATGTAGTTGATGAAGATGT-3′;IL-12:5′-ATGGATCAGGTCATAAGAGTATGAAAC-3′;IL-18：5′-AGAGAACTTGGTCATTCAAATTTCTT-A-3′;IFN-γ：5′-TCAGTTACCGAATAATTAGT-CAGCTTT-3′;TGF-α：5′-TTCTTCTCTAGGTCA-CACTGAATAACC-3′;TGF-β1：5′-CCAAGGTGCTCAATAAATAGATCTAAC-3′;GM-CSF：5′-CAAACATTTCTGAGATGACTTCTACTG-3′;TNF-α：5′-AACTTTATTTCTCGCCACTGAATAGTA-3′。将13种细胞因子分为5组:IL-2、IFN-γ、IL-12和IL-18为Th1型细胞因子;IL-4和IL-10为Th2型细胞因子;TGF-β1为免疫抑制细胞因子;IL-1、IL-3、IL-8为致炎细胞因子的代表;TGF-α、TNF-α和GM-CSF。采用地高辛(DIG)寡核苷酸末端标记试剂盒标记探针,标记过程严格按照产品说明书进行，标记的探针活性为1.56 nmol/L。

　　1.2.2 细胞因子的原位杂交 细胞涂片和组织石蜡切片的制备：整个操作过程均在无酶的环境中按常规操作进行。组织切片经脱蜡、消化和固定,并经梯度乙醇脱水后，室温干燥，于42 ℃先加预杂交液10~30 mL在盒内预杂交2 h，然后加杂交液10~30 μL，在42 ℃杂交22 h。以梯度标准枸橼酸盐水(SSC)充分洗涤后，加抗体于37 ℃作用2 h，再以NBT-BCIP显色18 h。用Buffer Ⅲ作用5 min终止显色反应，加10 g/L甲基绿复染1~2 min，依次进行流水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明及封片后镜检。对照设置：将探针和抗体用PBS取代或将切片在37 ℃ RNase A (20 mg/L) 处理3 min, 分别作为细胞涂片和石蜡切片的阴性对照;以正常人活化的外周血淋巴细胞中的IL-2和INF-γ mRNA作为细胞涂片的阳性对照;以慢性扁桃体炎组织中IL-2和INF-γ mRNA的表达作为石蜡切片的阳性对照。结果判定：光镜下细胞质中出现紫蓝色沉淀者为阳性杂交信号;阴性对照无杂交信号，甲基绿复染的细胞质不着色，胞核呈绿色。在装有网格目镜的高倍镜下,每张切片随机取5个视野,计数200个细胞,计算阳性细胞的百分数,并根据细胞中阳性颗粒数的多少及颜色的深浅分为：阴性(-)、弱阳性(+)、阳性()、强阳性()，并分别记为0、1、2、3分。将阳性细胞的百分率与染色强度积分的乘积作为积分指数(IE)。

　　1.2.3 统计学处理 数据以x±s表示，用ANOVA和Student t检验进行显著性分析。

　　2 结 果

　　2.1 胸腔积液的淋巴细胞中细胞因子的表达

　　在结核性胸腔积液的淋巴细胞中，IL-2、INF-γ、IL-12、IL-18、IL-4、IL-10及TGF-α mRNA的表达水平很低，且无显著差异(P>0.05)，而GM-CSF mRNA的表达水平增高，明显高于其他细胞因子(F=11.58,q=7.70～10.74,P<0.01)。IL-1和IL-3 mRNA的表达水平也增高，明显高于IL-8、INF-γ、TGF-α和IL-12 mRNA的水平(F=6.68,q=6.72～9.70,P<0.05)。而在NSCLC病人胸腔积液中，IL-2、INF-γ、IL-12、IL-18 mRNA的表达水平很低，且无明显差异(P>0.05)。与Th1型细胞因子mRNA的表达相比较，Th2型细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β1及TGF-α mRNA的水平明显增高(F=65.15,q=3.66～21.03,P<0.05)，尤其是IL-10和TGF-β1。GM-CSF和TGF-β1 mRNA的水平也明显高于IL-2和IL-12(F=119.60,q=7.74～20.54,P<0.05)。在3种致炎性细胞因子中， IL-1 mRNA的水平明显高于1型细胞因子(F=65.45,q=3.66～21.03,P<0.05)。总的来看，Th2型细胞因子mRNA在NSCLC病人胸腔积液的淋巴细胞中的表达占优势;而致炎性细胞因子mRNA的水平仅轻微增高。结核性胸膜炎胸腔积液中，Th2型细胞因子mRNA表达的水平明显低于NSCLC病人(t=10.33～11.64,P<0.01);而两种胸腔积液中Th1型细胞因子中除INF-γ有所升高外(t=7.87,P<0.05)，IL-2、IL-12和IL-18的表达水平则无显著差异(P>0.05)。另外，致炎性细胞因子mRNA的表达水平明显增高(t=11.65～15.58,P<0.01);两种胸腔积液中GM-CSF mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05)。见表1。

　　2.2 NSCLC组织细胞因子mRNA的表达

　　在NSCLC组织中,Th1型细胞因子mRNA的阳性细胞数很少,相应细胞因子mRNA的表达水平也很低,并且阳性细胞主要是肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)。18例标本中,Th2型细胞因子均呈中度至高度表达, 4例IL-10 mRNA呈高度表达,14例呈中度表达; 2例IL-4 mRNA呈高度表达,16例呈中度表达。苏木精-伊红染色显示,肿瘤细胞和TIL均可表达Th2型细胞因子,且肿瘤细胞表达占重要地位。在肿瘤细胞和TIL中, GM-CSF mRNA均有较明显的表达,16例呈中度表达,2例呈轻度表达;但Th1型细胞因子的表达明显缺乏或仅轻度表达。在18例标本中,6例不表达IL-2 mRNA,7例不表达INF-γ mRNA,8例不表达IL-12 mRNA,7例不表达IL-18 mRNA。另外，Th1型细胞因子主要在TIL中表达,几乎未观察到在肿瘤细胞中表达。GM-CSF和TNF-α mRNA的阳性细胞数量及其表达水平,明显高于Th1型细胞因子和其他致炎性细胞因子。GM-CSF mRNA的表达水平仅次于IL-4和IL-10。肿瘤细胞和TIL均可表达GM-CSF和TNF-α mRNA。除GM-CSF mRNA在腺癌标本中的表达水平明显高于鳞癌外,其他各种细胞因子mRNA的表达水平与组织类型及肿瘤的病理分期无相关性。总之,在NSCLC组织中Th2型细胞因子mRNA的表达明显占优势。 表1 NSCLC和结核病人胸腔积液淋巴细胞中细胞因子mRNA的表达

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞虽可刺激荷瘤宿主产生特异性免疫应答,但临床上大多数肿瘤却可进行性生长,直至导致病人死亡,因此,肿瘤细胞为何可以逃逸宿主的免疫监视一直是研究的热点。以往认为,大多数肿瘤细胞的免疫原性弱,不能有效地激活宿主的免疫系统。近年研究发现,肿瘤细胞能激活肿瘤特异性细胞,并分泌Th2型细胞因子(如IL-4和IL-10等);而免疫原性强的肿瘤细胞则能诱发Th1型免疫应答,分泌IFN-γ等Ⅰ型细胞因子。可诱发Th1型免疫应答的肿瘤,似乎对免疫活性细胞的攻击更敏感;而激发Th2型免疫应答的肿瘤则呈持续生长,肿瘤局部的免疫微环境在决定抗瘤免疫的最终结局中起关键作用[1]。因此,不能简单地认为,宿主的免疫系统不能识别肿瘤,而是由于肿瘤抗原主要激活Th2型细胞并分泌Ⅱ型细胞因子或其他免疫抑制因子,导致肿瘤局部的免疫微环境处于抑制状态所致。

　　由Th1和Th2型细胞分泌的细胞因子在抗瘤免疫应答的建立及其调节中起重要作用[2]。然而,长期以来认为大多数肿瘤“无或只有弱的免疫原性”,因而不能激发宿主的免疫系统。有研究表明,所谓的“无或只有弱免疫原性”和“强免疫原性”的肿瘤均能诱导免疫应答,而仅仅是诱导的免疫应答的类型不同,肿瘤特异性免疫应答与病人的预后有明显的相关性[3]。诱发Th1型免疫应答的肿瘤可能被排斥,而激活Th2型免疫应答的肿瘤仍可继续生长[1]。最近,我们以小鼠低免疫原性和高免疫原性的瘤细胞,分别与同系小鼠的脾细胞混合培养后,分析了其免疫微环境的差异。结果显示,以高免疫原性的瘤细胞FBL3或H22刺激后,同系小鼠脾细胞的增殖指数高于低免疫原性的瘤细胞D5刺激后。与高免疫原性的瘤细胞FBL3或H22相比较,在与低免疫原性的瘤细胞D5混合培养后,同系小鼠的脾细胞中,含有较多的T调节性细胞(TB)和CD4+IL-10+细胞,其培养上清中含有较高水平的IL-10;而INF-γ的水平很低。NEUNER等[4]研究表明,Th2型细胞因子与NSCLC的疗效有关,因肿瘤刺激Th2型细胞分泌的IL-10可抑制IL-2的分泌,故认为病人的预后较差。本研究的结果也证实,在NSCLC的局部及胸腔积液标本中,Th2型细胞因子和免疫抑制细胞因子mRNA的表达水平明显增高。LIU等[5]用RT-PCR和斑点杂交法也证实,20种不同的人肿瘤细胞株中,Th2型细胞因子呈高表达。ASSELIN-PATUREL等[6]报道的NSCLC病人Th1、Th2型细胞因子和TGF-β1的表达水平,与本实验的结果一致。

　　GM-CSF是目前认为佐剂作用最强的一种免疫增强型细胞因子,许多研究已表明,荷瘤动物接受GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗治疗后,可使肿瘤缩小[7]。然而,新近的研究结果则提示,造血生长因子(例如G-CSF、GM-CSF)可促进肿瘤的生长,因G-CSF和GM-CSF在体内可通过招募单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞至肿瘤部位,使肿瘤间质中的炎性细胞数增多,并伴随血管的生成[8]。另有报道,表达G-CSF和GM-CSF的肺鳞癌病人与不表达的病人相比预后较差[9]。因而认为，GM-CSF在一些NSCLC病人中可刺激肿瘤生长。而目前临床上多用大剂量的GM-CSF来提高NSCLC病人化疗和放疗后的造血功能,因此,有必要进一步研究GM-CSF对肿瘤生长的影响。

　　总之,由于细胞因子及其功能的多样性和复杂性,分析单一一种细胞因子mRNA的表达,尚不足以更好地评价肿瘤局部的免疫微环境。在本实验研究中,我们分析了13种不同细胞因子的表达,较全面地揭示了为NSCLC局部的免疫微环境处于抑制状态,这对于了解肿瘤逃逸免疫监视的机制以及为NSCLC的免疫治疗提供了一定的实验依据。

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　　[9] OSHIKA Y, NAKAMURA M, ABE Y, et al. Growth stimulation of non-small cell lung cancer xenografts by granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)[J]. Eur J Caucer, 1998,34(12):1958-1961.