氟伐他汀对大鼠放射性肺损伤防治作用的实验研究

　　作者：叶江枫，戚好文，蒙育林，范风云，梁军，任东青 ,杜志强

　　作者单位： 1 830000 新疆乌鲁木齐，兰州军区乌鲁木齐总医院呼吸内科(△小儿科)

　　2 710032 陕西西安，第四军医大学西京医院呼吸内科(*放疗科)

　　3 710038 陕西西安，第四军医大学附属唐都医院放疗科

　　4 710032 陕西西安，第四军医大学防原医学教研室

　　[摘要] 目的 观察氟伐他汀对放射性肺损伤的防治作用，为放射性肺炎和肺间质纤维化的治疗探索一种新的方法。方法 雌性SD大鼠50只随机分为正常对照组(C组)，单纯照射组(R组)和氟伐他汀防治组(F组)。治疗组于照射前7天以氟伐他汀20 mg/(kg?d)灌胃，另两组灌服等量生理盐水直至实验结束。照射组和治疗组给予直线加速器照射，照射剂量单次20 Gy/min，于照射后5、15、30、60天取肺组织作HE，Masson，甲苯胺蓝染色及透射电镜，免疫组化法测定TGF-β1的表达，HE及免疫组化染色以计算机图像分析系统测定，数据用重复测量多因素方差分析和T检验。 结果 治疗组大鼠肺炎和肺水肿比照射组明显减轻。照射组大鼠肺组织胶原纤维量比治疗组明显增多。照射组15、30、60天肥大细胞数量逐渐增多(P<0.01)，而治疗组减少(P<0.01)，电镜显示Ⅱ型肺泡细胞和毛细血管内皮细胞30天时照射组较治疗组明显损伤，照射组30、60天肺间质增厚(P<0.01)，治疗组减轻，照射组TGF-β1的表达在30、60天较治疗组明显增高(P<0.01)。结论 氟伐他汀能抑制放射性炎症和组织损伤，可用于预防和治疗放射性肺损伤。

　　[关键词] 氟伐他汀;放射性肺损伤;形态学;TGF-β1

　　Preventive effects of fluvastatin on radiationinduced lung injuries in rats

　　YE Jiangfeng,QI Haowen,MENG Yulin,et al.Department of Respiratory Diseases,PLA General Hospital,Lanzhou Military Command,Urumqi 830000,China

　　[Abstract] Objective To assess the efficacy of fluvastatin for prevention and treatment of radiationinduced lung injuries in rat.To evaluate the possibility of using fluvastatin as a new therapy for pneumonia and pulmonary fibrosis induced by radiation. Methods 50 SD female rats were randomly divided into control,radiation group and treatment groups .Fluvastatin was given to rats in treatment groups at a dose of 20 mg/(kg?day) by gastrogavaging from seven days before radiation until the end of the experiment.The rats in other groups were gastrogavaged with the same amount of saline. Rats in the radiation group and treatment group were exposed to thoracic radiation at a dose of 20 Gy by linear accelerator. Lung tissue from each rat was obtained,fixed and examined by HE staining,masson staining,toluidine blue staining and transmission electron microscopy. Expression of TGFβ1 were measured by immunohistochemistry staining. The field of observation of HE staining and immunohistochemistry statining were measured by a computerized image analysis system. The data were analyzed by ANOVA and students t test. Results Pneumonia and pulmonary edema in rats of treatment group were much less severe than in radiation group.The amount of collagen fibers in lung tissue from rats of radiation group increased significantly compared to treatment group.The number of mast cells was increased gradually in radiation group on days 15,30,60(P<0.01),but decreased in treatment group(P<0.01).Electron microscopy showed that type Ⅱ pneumonocytes and lung capillary endothelial cells were much more severely injured in radiation group on day 30 than in treatment group.The area of mesenchyma was increased in radiation group on day 30 and day 60(P<0.01),and decreased in the treatment group(P<0.01). The expression of TGFβ1 was high in radiation group on day 30 and day 60 (P<0.01) than in treatment group on days 15,30 and 60(P<0.01). Conclusion Fluvastatin might inhibit radiationinduced inflammation and tissue damage and could be used to prevent and treat radiationinduced lung injuries.

　　[Key words] fluvastatin;radiationinduced lung injury;pathomorphology;TGFβ1

　　放射性肺损伤是核辐射事故,骨髓移植预处理及胸部肿瘤放疗后常见的并发症。由于放射性肺损伤早期的放射性肺炎,后期肺间质纤维化的存在,很大程度上限制了胸部肿瘤放疗及骨髓移植的发展,也使得平时、战时核辐射损伤的防治更加困难。然而目前缺少有效的防治措施，如何解决这个难题是放射生物学研究的热点之一。有报道氟伐他汀能有效地防治肺间质纤维化[1]。为此,我们探索氟伐他汀对放射性肺损伤的防治作用，为放射性肺损伤的早期治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 直线加速器(英国公司的8MV-X),氟伐他汀(瑞士诺华公司提供)。图像分析系统(德国LEICA公司的Q500MC),TGF-β1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)。

　　1.2 动物分组及给药 雌性SD大鼠50只由第四军医大学实验动物中心提供，体重(180±20)g,随机分为正常对照组(C组)、单纯照射组(R组)、氟伐他汀防治组(F组)。F组于照射前7天以氟伐他汀20 mg/(kg?d)灌胃，另两组灌服等量生理盐水。R组、F组腹腔内注射硫喷妥钠40 mg/kg，动物麻醉后行直线加速器单次照射，剂量为20 Gy，面积4.5 cm× 4.5 cm(全胸)，剂量率为3 Gy/min，距离1 m。

　　1.3 病理学观察及定量测定 于照射后5、15、30、60天以硫喷妥钠40 mg/kg腹腔内注射，麻醉后剪开胸腔，取大鼠右中下肺浸入10%福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，制作石蜡切片(5 μm)，行HE染色，光学显微镜下观察，用 LEICAQ500MC图像分析系统(德国)测定肺间质面密度;Masson染色观察基质胶原纤维变化;甲苯胺蓝染色观察肥大细胞数密度变化。取左下肺组织1 mm3大小肺组织2~5块置入3%戊二醛溶液固定，备作透射电镜，观察Ⅱ型肺泡上皮细胞，血管内皮细胞超微结构的变化。TGF-β1的表达选石蜡切片用免疫组化SABC法，按照试剂盒中说明书进行操作，光学显微镜观察结果。以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照，试剂盒中提供阳性对照片。免疫组化阳性结果为细胞质/膜染成棕黄色或黄色，采用图像分析仪随机测定细支气管TGF-β1表达的灰度值，取其平均值。TGF-β1表达越弱，灰度值越大; TGF-β1表达越强，灰度值越小。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS10.0版统计软件包，以实验设计方差分析进行显著性检验，所有数据以均数±标准差(x±s)表示。

　　2 结果

　　2.1 大体肺组织标本观察 肺组织脆性增加,可呈肝样实变,肺表面有白色灶状病灶。

　　2.2 HE染色 C组：光学显微镜下观察显示正常肺组织。R组：照射后5天间质细胞增多，主要为中性白细胞，15天出现肺泡腔减小，肺泡腔内有泡沫细胞，炎症细胞可见多形核细胞、巨噬细胞。30、60天除上述改变外，肺泡腔内纤维素样渗出和水肿液，肺间质严重增厚，局部肺实变，有的出现肺脓肿，纤维母细胞不同程度增生，有较多中性白细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞浸润，泡沫细胞成堆，红细胞漏出。60天时局部有肉芽组织增生，成纤维细胞数量增多。F组：照射后5天炎症细胞浸润和肺水肿与R组比较无明显变化。15天肺间质增厚与R组比较变化不明显，泡沫细胞、多形核细胞、巨噬细胞渗出减少。30、60天肺水肿明显减轻，无肺实变发生，炎症细胞渗出明显减少。无肉芽组织增生。

　　2.3 肺组织间质面密度定量测定 每组选3张切片,每张切片选4个低倍镜视野进行图像分析。单次20 Gy照射各组的肺间质面密度变化(视野面积0.24 mm2)，见表1。表1 照射20 Gy不同时间肺间质面密度变化 (略)注：①表示R组与C组比较P<0.01;②表示F组与R组同期比较P<0.01

　　如表1显示：R组肺间质面密度于30、60天时明显增大(P<0.01)，F组同期明显减小(P<0.01)，照射后随着肺部炎症的加重,肺间质面积逐渐增大至肺实变,同期氟伐他汀治疗后肺间质面积显著减小。

　　2.4 Masson染色结果 C组显示少量淡蓝色的胶原纤维分布在脏层胸膜下、支气管和血管周围。R组显示在5、15天基质胶原纤维无明显变化，而30、60天支气管、血管、脏层胸膜下胶原纤维明显增多，30、60天组肺间质出现胶原纤维。F组5、15天变化不明显，30、60天明显减少。

　　2.5 肥大细胞变化 C组在脏层胸膜下、血管、支气管周围有少量染成紫色的肥大细胞,R组照射后随着肺损伤的加重,肥大细胞逐渐增多; F组与R组同期比较明显减少。肥大细胞记数每组动物选5张切片,每张选3个高倍镜视野,各组肥大细胞数密度变化见表2。 R组在15、30、60天肥大细胞增多P<0.01，F组15、30、60天明显减少P<0.01。

　　2.6 肺组织电镜超微结构改变 C组显示正常肺组织细胞及细胞器。R组在30、60天显示肺实变，细胞结构不清，Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀明显(图1)，毛细血管内皮细胞肿胀，血管腔内可见中性白细胞、巨噬细胞、肥大细胞增多，肥大细胞胞浆内电子密度高。气血屏障增宽，腔内有出血，间质胶原纤维增生，F组在30、60天 (图2)，毛细血管内皮细胞肿胀消失，气血屏障恢复正常。血管腔内未见有炎症细胞，纤维蛋白渗出减少。

　　2.7 TGF-β1表达及定量测定 正常肺组织TGF-β1在细支气管平滑肌、血管平滑肌、血管内皮、血管周围仅有弱表达;R组在30、60天时上述部位明显比C组表达增强，并出现肺间质肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、细支气管黏膜上皮细胞强阳性表达(图3)，F组与R组同期比较其表达减弱(图4)。

　　每组动物选取3张切片,每张切片取3个低倍镜视野图像分析测定 TGF-β1的灰度值见表3。表2 照射后不同时间肥大细胞数密度的变化 (略)注：①表示R组与C组比较P<0.01;②表示F组与R组同期比较P<0.01

　　图1 R组照后30天大鼠肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀(透射电镜 ×8000);图2 F组照后30天大鼠肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀消失(透射电镜×8000);图3 R组照后60天大鼠肺细支气管TGF-β1表达强阳性(SABC ×400);图4 F组照后60天大鼠肺细支气管TGF-β1表达弱阳性(SABC ×400) 表3 各组不同时间 TGF-β1表达的灰度值 (略)注：①表示R组与C组比较P<0.01;②表示F组与R组同期比较P<0.01

　　R组在30、60天TGF-β1表达测定的积分光密度值与C组比较明显减小P<0.01，说明R组TGF-β1表达较C组强;F组积分光密度值15、30、60天较R组高P<0.01，说明F组TGF-β1的表达较R组弱。照射后随着肺损伤的加重,TGF-β1在肺组织的表达逐渐增强,而氟伐他汀治疗15天后即可抑制 TGF-β1在肺部的表达。

　　3 讨论

　　放射性肺损伤病理变化规律，有的学者将其分为四期：早期，此期以渗出为主(0.5～1个月);中期改变，以肉芽生长为主(2～3个月);后期改变，以纤维增生为主(3～6个月);晚期改变，胶原化病变为主(6个月以后)[2]。我们所建立的放射性肺损伤动物模型完全符合这一病理改变。由于照射引起肺泡壁通透性的改变，产生反应性炎性变化，出现纤维素和血清蛋白漏入肺泡腔和肺泡壁中。纤维素可以机化形成网状弹性骨架，并逐渐发生纤维化。其次，急性期血管的损伤有可能使血管组织交界处产生水肿，水肿液中含有大量的蛋白质，这种体液的堆积最终可导致纤维化[3]。实验显示R组在照射后5天，有炎症细胞见渗出，30、60天时纤维素样物和炎症细胞渗出导致肺水肿、肺实变，而氟伐他汀防治组在30、60天时炎症细胞渗出减少，水肿及纤维素样物渗出减轻，说明氟伐他汀能有效地减轻炎性细胞及炎性渗出。研究 [4]发现氟伐他汀可抑制IL-1和IL-6 mRNA的表达及其蛋白的分泌。

　　肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型细胞是放射引起损伤的靶细胞[5]。本实验电镜检查显示照射后，Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀，细胞数量减少，毛细血管内皮细胞肿胀空泡样变。F组显示氟伐他汀对肺Ⅱ型上皮细胞毛细血管内皮细胞损伤有修复作用。

　　肥大细胞参与了放射性肺损伤，肥大细胞和成纤维细胞间存在“颗粒传导”，成纤维细胞吞噬肥大细胞外溢颗粒，继之被颗粒中的肝素和5-HT等激活，从而导致胶原蛋白合成和分泌增加。通过F组实验发现氟伐他汀能明显减少肥大细胞数量，这可能是氟伐他汀减少胶原纤维合成的机制之一。从实验中发现胶原纤维增生最早在照射后30天，氟伐他汀对胶原纤维增生有明显抑制作用，其机制是氟伐他汀能抑制成纤维细胞增生[6]，导致已增生的胶原纤维细胞大量凋亡[7]。

　　TGF-β1是诱发放射性肺间质纤维化重要的介质，特别是晚期[8]。 TGF-β1主要作用于胶原的转录和翻译过程，能诱导前胶原mRNA产生,从而促进胶原蛋白的形成和沉积[9]。在照射后30、60天 TGF-β1在肺组织表达明显增强,本实验结果表明氟伐他汀能抑制 TGF-β1的表达。 TGF-β1是由激活的巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞分泌,它能促进基质的合成,也能抑制已合成的细胞外基质的分解。氟伐他汀能抑制成纤维细胞的增殖[6],我们推测氟伐他汀是通过减少成纤维细胞数量来减少 TGF-β1的分泌。

　　放射性肺损伤的发病是一个多细胞多因子参与的复杂过程,本实验结果显示氟伐他汀可以作用于发病的多个环节,能有效地治疗实验性放射性肺损伤，这为临床应用以及军事医学上的实际应用提供了实验基础。

　　[参考文献]

　　1 赵峰,戚好文,赵一岭,等.氟伐他汀对博莱霉素A5致大鼠肺纤维化的治疗作用.第四军医大学学报,2002,23(6):493-496.

　　2 白蕴红,王德文,徐在海,等.放射性间质性肺炎的病变规律及其机理研究.解放军医学杂志，1993,18(1):14-18.

　　3 谷铣之,殷蔚伯,刘泰福,等.肿瘤放射治疗学.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993,244-245.

　　4 Inoue Y,King TE,Tinkle SS,et al.Human mast cell basic fibroblast growth factor in pulmonary fibrotic disorders.Am J Pathol,1996,149(6):2037-2053.

　　5 Meyrick B.Early structure changes in shep lung following thoracic irradiation.Radiat Res,1998,114;138-153.

　　6 Negre-Aminou P,Van Vliet AK,Van Erck M,et al.Inhibition of proliferation of human smooth muscle cells by various HMG-COA reductase inhibitors;comparision with other human cell types.Biochim Biophys Acta,1997,1345(3):259-268.

　　7 Tan A,Lerrey H,Dahm C,et al.Lovastatin induces fibroblast apoptosis in vitro and in vivo A possible therapy for fibroproliferative disorders.Am J Respir Crit Care Med,1999,159(1):220-227.

　　8 Rodemann HP,Peterson HP,Schwenke K,et al.Terminal differentiation of human fibroblast is induced by radiation.Scanning Microsc,1991,5(4):1135-1142;discussion 1142-1153.

　　9 Bienkowski RS,Gotkin MG.Control of collagen deposition in mammalian lung.Proc Soc Exp Biol Med,1995,209(2):118-140.