青藤碱对肺腺癌细胞系A549增殖和凋亡的影响

　　作者：姜廷枢 李胜岐 作者单位：(中国医科大学附属盛京医院呼吸科，辽宁 沈阳 110001)

　　【摘要】 目的 研究青藤碱(SIN )对肺癌A549细胞增殖的影响及其机制，为SIN预防和治疗肺癌提供实验依据。方法 SIN高(1.0 mmol/L)、中(0.5 mmol/L)、低(0.25 mmol/L)剂量组及空白对照组分别处理体外培养的人肺癌细胞系A549细胞后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测处理24、48、72 h后A549细胞的增殖活性;采用流式细胞仪测定各剂量组SIN作用48 h后细胞周期;采用流式细胞术和TUNNEL方法检测细胞凋亡。结果 高、中、低剂量组SIN处理A549细胞48、72 h后，细胞增殖明显受到抑制，且呈时间、剂量依赖性。SIN处理组G1期细胞比例明显增加，与空白对照组比较有统计学意义。SIN处理组细胞凋亡率也较对照组升高，呈剂量依赖性。TUNNEL法可见凋亡细胞的阳性反应。结论 SIN在体外能有效抑制肺癌细胞生长，其机制与其阻滞细胞周期于G1期、诱导细胞凋亡有关。

　　【关键词】 肺癌;青藤碱;细胞凋亡

　　青藤碱(SIN)是抗风湿中药青风藤(Sinomeninum scutum Rehd.et Wils.)的单体提取物，其分子式为C19H23NO4，分子量329.38。SIN具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、抗血管生成、抗心律失常等药理作用〔1～5〕。新近研究发现SIN对肝癌、宫颈癌细胞的增殖具有抑制作用〔6，7〕，可以阻滞细胞周期并诱导肿瘤细胞的凋亡，但SIN对肺癌细胞是否有抑制作用尚未见报道。本实验探讨SIN对非小细胞肺腺癌细胞系A549的影响，为治疗肺癌提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料与仪器 人肺癌A549细胞由中国医科大学细胞生物教研室提供，细胞来自美国国立细胞库(ATCC);SIN干粉(纯度98%，白色粉末，西安赛邦医药科技有限公司提供);RPMI1640培养基(Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(以色列Biological Industries公司);胎牛血清(天津索莱宝生物工程有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，南京凯基生物科技发展有限公司);二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)与RNA酶(Sigma公司);Annexin VPI双染试剂盒(欣博盛生物科技发展有限公司);酶标仪(BioRad550,美国)、倒置显微镜(Olympus X70型，日本);超净工作台(蚌埠净化设备厂)、离心机(Eppendorf 525L型，德国);流式细胞仪(BECTONDICKINSON，美国)。

　　1.2 细胞培养及分组 用含10%小牛血清的56℃灭活胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，实验均取对数生长期细胞，调整细胞浓度为0.5×106～1×106/ml。接种细胞24 h进入对数生长期后开始进行药物干预。

　　1.3 MTT法检测细胞增殖 细胞调整成浓度为5.0×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，实验设6个复孔，并设空白对照。接种24 h，镜下观察确认细胞贴壁良好。实验组加系列稀释的高、中、低剂量SIN溶液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25 mmol/L)。实验设含RPMI1640全培养基的空照和未予药物作用的阴性对照。细胞在37℃,CO2培养箱分别培养24、48、72 h。结束培养前4 h小心吸去细胞培养液，每孔加MTT 20 μl，37℃继续培养4 h后小心吸去上清，每孔加DMSO 150 μl，振荡混匀10 min，使甲瓒溶解。酶标仪检测波长570 nm的每孔光密度值(OD值)。实验重复3次。增殖抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值×100%

　　1.4 流式细胞技术(FCM)检测SIN对A549细胞周期的作用 细胞以1×106接种于6孔板中，加入终浓度为系列稀释的高、中、低剂量SIN溶液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25 mmol/L)，并设空白对照组(加等量RPMI1640培养基)，分别于37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养48 h后0.25%胰酶消化,加含血清培养基中和胰酶后收获细胞，以1 500 r/min，4℃离心8 min。沉淀用冷PBS洗涤并离心2次后，用75%预冷酒精重悬固定过夜。检测前将细胞悬液离心后PBS洗涤1次，加入PI染液1 ml(50 μg/ml)，混匀后4℃避光放置30 min，以FACSCallbur型流式细胞仪检测分析，结果用专业软件ModFit获取分析数据。每组实验重复3次。

　　1.5 流式细胞技术Annexin VFITC法检侧A549细胞凋亡 细胞以1×106接种于6孔板中，培养24 h后加入终浓度为系列稀释的高、中、低剂量SIN溶液，使终浓度依次为(1.0,0.5,0.25 mmol/L)，并设空白对照组(加等量RPMI1640培养基)，37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养48 h后胰酶消化收获细胞。空白对照组以培养基替代SIN离心收集悬浮细胞，2 000 r/min，离心8 min，弃培养基。用冷PBS洗涤离心细胞2次。用400 μl 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×106个/ml。在细胞悬浮液中加入5 μl AnnexinVFITC，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育15 min。加入10 μl PI后轻轻混匀于2℃～8℃避光条件下孵育5 min。在1 h内用流式细胞仪检测。结果用Cellquest专业软件获取分析数据。每组实验重复3次。

　　1.6 TUNNEL检测凋亡 实验分组：对照组、SIN处理组。接种处于对数生长期的细胞到75 cm2培养瓶中，24 h后加入浓度为1 mmol/L的SIN。处理后72 h，移弃各孔中的旧培养液，PBS冲洗后用0.25%胰酶+0.02 mol/L EDTA消化法收集细胞，室温离心，1 500 r/min，离心10 min。用PBS溶解细胞后涂片。自然晾干的细胞样本浸入固定液，室温25℃固定30 min(固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中， PBS漂洗浸入封闭液中，室温封闭10 min，PBS漂洗浸入通透液中，冰上促渗2 min进入标记反应，余下步骤按试剂操作说明进行。

　　1.7 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行数据分析，各组数据以x±s表示，实验组及对照组比较用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态观察 倒置显微镜观察到经SIN处理48 h后的A549细胞生长受到抑制，数目减少并出现贴壁生长细胞典型的凋亡形态变化现象。细胞体积缩小，由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。见图1。

　　2.2 体外细胞毒实验结果 SIN高、中、低剂量组在24 h对A549细胞生长无明显的抑制作用。当作用48 h和72 h后，各浓度组均有明显的抑制作用，抑制率分别为48 h：65.43%，58.85%，40.32%;72 h：76.46%，69.85%，52.76%。显示抑制率随药物作用时间和浓度的加大而增加，呈现出时间和剂量的依赖性。

　　2.3 SIN对A549细胞周期的影响 流式细胞仪分析表明，不同浓度SIN干预48 h后，SIN处理组较对照组G1期细胞比例明显增加(P<0.05)，且随着SIN 剂量的增加，G1期细胞比例上升更明显。高浓度组G1期明显增加，G2和S期明显减少，与空白对照组比较有显著差异(P<0.05)。见表1。

　　2.4 SIN对人肺癌A549细胞凋亡的影响 流式细胞AnnexinV/PI检测细胞凋亡表明，SIN作用48 h，随浓度的增高，早期和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，见表2。TUNNEL方法检测见凋亡细胞胞核棕黄色着色，并可见细胞内DNA呈片段化的改变，见图2。表2 SIN对A549细胞凋亡的影响

　　3 讨 论

　　肺癌尽管目前有多种治疗方法，包括分子靶向治疗，但疗效不令人满意，其5年生存率低于15%〔8〕。为了提高5年生存率，更多的治疗方法正在被探索之中。

　　近年来有报道称SIN可通过阻滞细胞周期并诱导凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖，有可能成为一种抗肿瘤治疗药物。Zhang等〔6〕报道了SIN可以抑制宫颈癌Hela细胞增殖，其机制是通过阻滞细胞周期于G1期并诱导细胞凋亡来实现的，SIN对其抑制作用呈时间和剂量依赖性。Gong等〔7〕研究发现SIN可以抑制肝癌HepG2细胞的增殖，诱导HepG2细胞发生凋亡，深入研究其机制认为可能与上调Fas与Apo2.7基因表达、下调Bcl2基因表达有关。本实验采用SIN作用于非小细胞肺癌细胞系A549，发现其体外实验中对A549细胞具有细胞增殖抑制作用，且有时间剂量依赖关系，形态学可以见明显的细胞毒效应，其发挥的增殖抑制主要在48 h后发生。进而采用流式细胞术发现其增殖抑制作用是由阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡来实现的。SIN可以改变细胞周期的分布，使其阻滞在G1期。其诱导的凋亡具有剂量依赖性，凋亡率随着SIN浓度的增加而增加。通过TUNNEL的方法从形态学上进一步确定了其具有的诱导凋亡的作用。可见SIN通过细胞周期的阻滞和凋亡的诱导来抑制细胞的增殖。

　　本实验结果提示：SIN在体外可以有效的抑制肺癌细胞系A549的生长，其机制与细胞周期阻滞和诱导凋亡有关。本研究为SIN治疗肺癌提供了实验室依据，但尚需进一步深入研究其抗肿瘤机制及临床应用，评估其抗肿瘤效果。

　　【参考文献】

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　　2 Liu L，Buchner E，Beitze D,et al.Amelioration of rat experimental arthritides by treatment with the alkaloid sinomenine〔J〕.Int J Immunopharmacol，1996;18(5):52943.

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　　4 Wang M，Chang C，Cheng J，et al.Activation of opioid mureceptor by sinomenine in cell and mice〔J〕.Neurosci Lett，2008;443(2):20912.

　　5 Kok T，Yue P，Mak N,et al.The antiangiogenic effect of sinomenine〔J〕. Angiogenesis，2005;8(1):312.

　　6 Zhang Y，Wu M，Li XG.Experimental study on the effect of selective COX2 inhibitor sinomenine on Hela cells〔J〕.Progr Modern Biomed，2006;6(1):3840.

　　7 Gong L，Gao Y.Apoptotic derivation of hepatoma carcinoma cell by Kukoline〔J〕.J Chengdu Univers Tradit Chin Med,2007;30(1):389.

　　8 Erridge S，Moller H，Price A，et al.International comparisons of survival from lung cancer：pitfalls and warnings〔J〕.Nat Clin Pract Oncol，2007;4(5):5707.